- •Глава 1. Обзор литературы
- •Глава 2. Экспериментальная часть
- •Глава 1. Обзор литературы
- •1.1. Функциональная характеристика изоцитратлиазы и ее роль в регуляции клеточного метаболизма
- •1.1.1. Общая характеристика глюконеогенеза
- •1.1.2. Глюконеогенез в растениях
- •1.1.3. Глюконеогенез у животных
- •1.1.4. Глиоксилатный цикл
- •1.1.4.1. Роль глиоксилатного цикла в глюконеогенезе
- •1.1.4.2.Субклеточная локализация изоцитратлиазы
- •1.1.4.3. Распространение глиоксилатного цикла
- •1.1.4.3.1. Рапространение глиоксилатного цикла у микроорганизмов, низших растений и грибов
- •1.1.4.3.2. Функционирование глиоксилатного цикла у высших растений
- •1.1.4.3.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных
- •1.1.5. Изоферментный состав изоцитратлиазы
- •1.2. Молекулярные аспекты регуляции ицл
- •1.2.1. Экспрессионная регуляция изоцитратлиазы
- •1.2.2. Генетические механизмы регуляции синтеза ицл
- •1.2.3. Характеристика структурной организации генетического материала изоцитратлиазы
- •1.2.4. Эволюция ферментов глиоксилатного цикла
- •1.3. Особенности метаболизма нетрадиционной культуры амаранта
- •1.3.1. Морфо-физиологические и биохимические свойства амаранта
- •1.3.2. Химический состав амаранта
- •Глава 2. Экспериментальная часть
- •2.1. Цель и задачи
- •2.2.2.2. Определение количества белка
- •2.2.2.3. Электрофоретические исследования белков
- •2.2.2.4. Специфическое проявление изоцитратлиазы
- •2.2.2.5. Исследование субклеточной локализации
- •2.2.2.6. Выделение суммарной клеточной популяции рнк
- •2.2.2.7. Проведение обратной транскрипции
- •2.2.2.8. Подбор праймеров
- •2.2.2.9. Проведение полимеразной цепной реакции
- •2.2.2.10. Секвенирование пцр-продукта
- •2.2.2.11. Проведение пцр в реальном времени
- •2.2.2.12. Статистическая обработка данных
- •2.3. Результаты исследования и их обсуждение
- •2.3.1. Динамика активности изоцитратлиазы из проростков амаранта
- •2.3.2. Изоферментный состав ицл в проростках амаранта
- •2.3.3. Исследование субклеточной локализации ицл
- •2.3.4. Идентификация генов изоцитратлиазы
- •2.3.4.1. Выделение суммарной клеточной популяции рнк
- •2.3.4.2. Проведение обратной транскрипции
- •2.3.4.3. Проведение полимеразной цепной реакции
- •2.3.4.4. Определение нуклеотидной последовательности продуктов полученных методом пцр
- •2.3.4.5. Изменение экспрессии генов изоцитратлиазы в проростках амаранта
2.2.2.8. Подбор праймеров
Так как специфичность ПЦР, т.е. отсутствие посторонних ампликонов, принципиально важна для количественного анализа, подбор праймеров был важным этапом работы. При этом в первую очередь учитывались GC – состав, уникальность последовательности в геноме, а также отсутствие самокомплементарности внутри праймера и в паре. При подборе праймеров для обратной транскрипции и ПЦР анализа оптимальными считали праймеры, имеющие >50% G/C – пар и не имеющие в геноме других мишеней, комплементарных более чем к 10-11 нуклеотидам на 3'-конце.
Подбор праймеров осуществляли на основе сравнения аминокислотных последовательностей изоцитратлиазы из разных организмов. Поиск гомологичных последовательностей в геномах нематоды, прокариот и растений проводился с использованием базы данных NCBI (США, http://www.ncbi.hlm.nih.gov/). Для этого проводили выравнивание последовательностей с помощью программы AliBee – Multiple alignment Release 2.0 (http://www.genebee.msu.su/services/malign_reduced.html) с целью выявления наиболее консервативных участков. Подобранные на основе аминокислотных последовательностей праймеры проверяли на наличие образования димеров и вторичных структур с помощью программы FAST PCR.
2.2.2.9. Проведение полимеразной цепной реакции
Последующую полимеразную цепную реакцию [Епринцев А.Т. Полимеразная цепная реакция как универсальный метод диагностики и идентификации генов / А.Т. Епринцев, Е.А. Москалев, В.Н. Попов // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. – 2001. – Т. 54, № 1. – С. 9-14.]с ген-специфичными вырожденными праймерами проводили с помощью набора реактивов AmpliSence (Хеликон, Россия).
Для ПЦР анализа использовали праймеры, подобранные на основе аминокислотной последовательности:
прямой - 5'-TGYGGNCAYATGGGNGG-3'; обратный - 5'-DCTRCARTTRTANGC-3'. Температура отжига праймеров составляла 54оС.
Реакция ПЦР проводилась на приборах «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) и Biometra Personal Cycler (Biometra, Германия) со следующими параметрами амплификации: предварительная денатурация при 95оС в течение 5 мин, затем 35 циклов: 95оС – 20 с, 54оС – 20 с, 72оС – 30 с, и, наконец, 72оС – 4 мин.
Исследование результатов полимеразной цепной реакции проводили при помощи электрофореза в 1% геле агарозы при напряжённости электрического поля 7 В/см. Окрашивание геля производилось 0,1% водным раствором бромистого этидия. Визуализация результатов проводилась с использованием трансиллюминатора с длиной волны 312 нм. Размер продуктов определяли путём сравнения с маркерами ДНК известной длины (СибЭнзим, Россия).
2.2.2.10. Секвенирование пцр-продукта
Разделение фрагментов ДНК проводили методом вертикального электрофореза в ПААГ различной концентрации [Maniatis T. Molecular cloning / T. Maniatis, E.F. Frisch // J. Sambrook // Cold Spring Harbor Lab. – 1982. – Vol. 65. – P. 141-146.]. Качество выделенной ДНК проверяли в 4% ПААГ, а для разделения ампликонов после проведения ПЦР использовали 5% ПААГ. Для визуализации фронта использовали смесь красителей бромфенолового синего и ксиленцианола. Электрофорез проводили в буфере ТВЕ (89 мМ Tris-HCl, 89 мМ борная кислота, 2 мМ EDTA, рН 8,0) в поле с напряжением 200-250 В и силой тока 70-110 мА. После разделения фрагментов гель окрашивали бромистым этидием и визуализировали на трансиллюминаторе.