1.2.3. Характеристика структурной организации генетического материала изоцитратлиазы

В настоящее время достаточно охарактеризован ген ИЦЛ метилотрофных дрожжей Pichia pastoris [Menendez J. The ICL1 gene of Pichia pastoris, transcriptional regulation and use of its promoter / J. Menendez, I. Valdes, N. Cabrera // Yeast. – 2003. – Vol. 20, №13. – P. 1097–1108.]. Продукт ген изоцитратлиазы найден скринингом геномной библиотеки P. pastoris. Используя пару вырожденных праймеров, данный ген был клонирован методом полимеразой цепной реакции. Размноженный ген ИЦЛ содержал открытую рамку считывания размером 1563 н.п. Секвенированный белок сотоял из 551 аминокислоты. Молекулярная масса субъединицы составила 60,6 кДa с высокой степенью гомологии ИЦЛ из других источников. Аминокислотная гомология составила 64 % с ИЦЛ Saccharomyces cerevisiae. Нозерн-блоттингом показано, что как у S. Cerevisiae, так и у P. pastoris уровень мРНК ИЦЛ зависят от углеродного источника, используемого для роста клеток [Menendez J. The ICL1 gene of Pichia pastoris, transcriptional regulation and use of its promoter / J. Menendez, I. Valdes, N. Cabrera // Yeast. – 2003. – Vol. 20, №13. – P. 1097–1108.]. Ген ИЦЛ, размером 1458 н.п., был изолирован из метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha [Berardi E. The Hansenula polymorpha isocitrate lyase gene / E. Berardi, A. Gambini, A.R. Bellu // Yeast. – 2003. – Vol. 20, N 9. – P. 803 – 811.]. Данная последовательность нуклеотидов кодирует 486 аминокислот белка с молекулярной массой субъединицы 54,9 kДa. Этот белок короче, чем ИЦЛ из Saccharomyces cerevisiae и Candida tropicalis. Транскрипционное регулирование уровня мРНК главным образом достигнуто репрессией – дерепрессией глюкозы, причём индукция этанолом вносит незначительный вклад в повышение уровня мРНК [Osumi M. Microbody-associated DNA in Candida tropicalis / Osumi M.,Kazama H.,Sato S. // FABS Lett. – 1978. – Vol-90, №2. – P. 309–312.].

Другими исследователями была расшифрована кДНК (длиной 1463 п.н.) из Strongyloides stercoralis . Сиквенс нуклеотидной последовательности кДНК, показал, что она кодирует ИЦЛ. Концептуально полученная (с помощью таблицы генетического кода) аминокислотная последовательность с открытой рамкой считывания кодирует белок размером 450 аминокислотных остатков с молекулярной массой субъединицы 50 kДa. Секвенирование нуклеотидной последовательности показало содержание A/T равное 69 %. Последовательность аминокислот ИЦЛ S.stercoralis сопоставима с таковой последовательностью бифункционального белка ИЦЛ Caenorhabditis elegans, Chlamydomonas reinhardtii и Myxococcus xanthus. Вся кДНК S. stercoralis была экспрессирована в pRSET вектор с использованием промотора бактериофага T7. После чего ИЦЛ была очищена с помощью металафинной хроматографии [Siddiqui A. A. Cloning and expression of isocitrate lyase from human round Strongyloides stercoralis / A. A. Siddiqui, C. S. Stanley, S. L. Berk // Parasite. – 2000. – Vol. 7. – P. 233–236.].

Показано, что в мышечных клетках, а также клетках кишечника C. elegans в избытке содержится белок с молекулярной массой 106 кДа, который обладает ИЦЛ и МС каталитическими активностями. Данный белок назван бифункциональным белком глиоксилатного цикла. Его кДНК состоит из 3274 п.н.. N-концевой домен белка из 443 аминокислотных остатков и имеет значительную степень гомологии с ИЦЛ бактерий, грибов и растений (71 % гомологии с ИЦЛ E. coli). C-концевой домен состоит из 517 остатков аминокислот. Несмотря на то, что данные по исследованию семейств генов и белков эволюционно сближают животных с грибами, а растения с бактериями, аминокислотные последовательности изоцитратлиазного и малатсинтазного доменов бифункционального белка C.elegans более сходны с последовательностями E. coli, чем S. cerevisiae.

Ввиду того, что ИЦЛ патогенных микроорганизмов рассматривается в качестве мишени для действия лекарственных препаратов, недавно была определена пространственная структура данного фермента из Mycobacterium tuberculosis [Sharma V. Structure of isocitrate lyase, a persistent factor of Mycobacterium tuberculosis. / V. Sharma, G. Sharma // Nat.Struct.Biol. – 2000. – Vol. 7. – P. 663–668.]. Знание структуры фермента чрезвычайно важно для подбора его эффективных ингибиторов.

Изоцитратлиаза (рис.3а) M.tuberculosis имеет гомотетрамерное строение (81A x 86A x 92A). Каждая субъединица фермента состоит из 14 -спиралей и 14 -структур. Все субъединицы устойчиво связаны взаимодействием спиралей. Восемь -спиралей и восемь -структур, составляющих самый большой домен и основу структуры, формируют /-баррель. Активный центр ИЦЛ типично для подобных структур формируется С-концевыми участками -структур. Плоская молекула глиоксилата в активном центре координационно связывается с ионом Mg²⁺, а также образует водородные связи с аминокислотными остатками Сер 91, Гли 92, Трип 93 и Арг 228 (рис.3b). Молекула сукцината связывается с другой частью активного центра фермента и формирует водородные связи с Асн 313, Глу 295, Арг 228, Гли 192 (первая карбоксильная группа) и Тир 347, Асн 313, Сер 315, Сер 317, Гис 193 (вторая карбоксильная группа) (рис 3с) [ Sharma V. Structure of isocitrate lyase, a persistent factor of Mycobacterium tuberculosis. / V. Sharma, G. Sharma // Nat.Struct.Biol. – 2000. – Vol. 7. – P. 663–668.].

Рис.3. Пространственная структура изоцитратлиазы M.tuberculosis

(а) гомотетрамер ИЦЛ; (b) Отдельная cубъединица ИЦЛ: α – спираль показана тёмным тоном, β – складчатость - светлым. В активном центре находится Cysteine (Cys 191) ковалентно связанный с ингибитором 3-бромопируватом (BP). Ион Mg ²⁺ в активном центре представлен сферой; (с) Взаимодействие аналога сукцината, 3-нитропропионата и глиоксилата. Показан активный центр мутанта ИЦЛ C191S, образующий комплекс между глиоксилатом и 3-нитропропионатом. Соответственно обозначены аминокислоты, формирующие активный центр. Информация доступна в Банке данных белка кодами 1F61, 1F81 и 1F8M, соответственно.