2.3.4.4. Определение нуклеотидной последовательности продуктов полученных методом пцр
Так как при проведении ПЦР анализа нами использовались вырожденные праймеры, подобранные на основе сравнения аминокислотных последовательностей в белковых молекулах ИЦЛ из организмов различных таксономических групп, возникла необходимость достоверно убедиться, что полученные ПЦР-продукты являются участками разных генов кодирующих изоцитратлиазу. Для этого полученные ПЦР-продукты экстрагировали из геля по методике, описанной в [Maniatis T. Molecular cloning / T. Maniatis, E.F. Frisch // J. Sambrook // Cold Spring Harbor Lab. – 1982. – Vol. 65. – P. 141-146.].
Очищенные нуклеотидные последовательности секвенировали и сравнили с генетической базой данных. Получили……………….
2.3.4.5. Изменение экспрессии генов изоцитратлиазы в проростках амаранта
Для оценки количественных показателей интенсивности работы генов кодирующих изоферменты изоцитратлиазы использовали метод ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя Sybr Green. Этот метод позволяет количественно оценить скорость транскрипции генов. Кроме того, ПЦР-РВ дает возможность оценить изменения в интенсивности работы гена в зависимости от экспериментальных условий и действия внешних факторов. Данный метод позволяет оценивать результаты работы гена, т.е. концентрацию мРНК, на основе анализа кДНК [Tzachi B. Kinetic Outlier Detection (KOD) in real-time PCR / B. Tzachi // Nucleic Acids Research. – 2003. – Vol. 31. – P. 105-109.]. Для этого суммарную РНК, выделенную из различных органов растения, экспонируемых в разные временные периоды, подвергали обратной транскрипции с целью получения кДНК.
Показано, что на 2-е сутки в проростках амаранта экспрессия генов достигла максимального значения, и величина относительных единиц экспрессии составило 1,53 ед. Далее уровень экспрессии постепенно снижался, и к 5-м суткам достиг минимального значения с величиной относительных единиц экспрессии равной 0,4 ед., что в 4 раза меньше, чем значение на 2-е сутки. Затем наблюдалось небольшое повышение уровня экспрессии генов, и к 9-м суткам ее значение снизилось в 2,3 раз по сравнению с максимальным значением, но увеличилось в 1,75 раз относительно минимального значения, и величина относительных единиц экспрессии равна 0,7 ед. (Рис. ?).
Рис.
? Относительный уровень экспрессии
генов изоцитратлиазы в проростках
амаранта.
Кроме того, параллельно проводили измерение активности ИЦЛ в течение всего исследуемого периода (рис ?.). Так, динамика активности ИЦЛ в проростках амаранта в течение 9-ти дней имела характерную колокообразную кривую с вершиной на 2-3-и сутки. Эти данные хорошо коррелировали со значением относительных единиц экспрессии генов icl.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изучение динамики активности изоцитратлиазы в проростках амаранта Amaranthus caudatus L. в течение 9 дней показало, что она индуцируется с первых дней прорастания и достигает максимального значения уже на 2-3 сутки. Возрастание активности ИЦЛ свидетельствует об активном функционировании глиоксилатного цикла. К 9 суткам величина активности ИЦЛ постененно снижалась.
Анализ изоферментного состава изоцитратлиазы в семенах исследуемого объекта показал, что в 3х-дневных проростках амаранта было обнаружено две изоформы фермента с различной электрофоретической подвижностью (Rf 0,27 и 0,31) (рис. ?).
В ходе исследование субклеточной локализации изоцитратлиазы методом дифференциального и изоплотностного центрифугирования выделили цитоплазматическую, глиоксисомальную, митохондриальную фракции. При этом активность ИЦЛ распределилась по фракциям неравномерно. Наибольшая активность фермента была сосредоточена преимущественно в осадке, содержащем грубую фракцию микротелец. В результате проведённых расчётов на основании равенства активности каталазы и ИЦЛ в пероксисомах и цитоплазме было выявлено, что изоцитратлиаза из проростков амаранта имеет две изоформы, одна из которых имеет глиоксисомальную локализацию, а вторая представлена в цитоплазме.
Изучение, включавшее выделение суммарной клеточной популяции РНК, проведение обратной транскрипции, получение комплементарной ДНК и ОТ-ПЦР анализ, показало, что в ходе прорастания семян амаранта экспрессируются оба гена изоцитратлиазы - icl1 и icl2.
Секвенирование???
Изменение экспрессии генов icl в проростках амаранта показало максимальное значение относительных единиц экспрессии (1,53 ед.) на 2-е сутки. К 5-м суткам это значение снизилось до минимального (0,4 ед.), и далее наблюдалось незначительное повышение уровня экспрессии на 9-е сутки (0,7 ед.), что связано по-видимому с истощением запаса питательных веществ в семенах. Также наблюдалась корреляция динамики активности ИЦЛ со значениями относительных единиц экспрессии генов icl.
Таким образом, анализ полученных в ходе исследования данных позволяет заключить, что глиоксилатный цикл может иметь более универсальное распространение в организмах, чем считалось ранее. При этом данный метаболический путь не функционирует на протяжении всего онтогенеза, а индуцируется на определенных его стадиях и выполняет ключевую роль в мобилизации запасного пула жирных кислот.
ВЫВОДЫ
1. Изучение динамики активности ИЦЛ из проростков амаранта показало, что максимальное значение активности фермента наблюдалось на 2--3 день прорастания, что связано с интенсификацией глюконеогенеза.
2. Анализ изоферментного состава ИЦЛ показал наличие двух изоформ фермента с различной величиной электрофоретической подвижности (Rf 0,27 и 0,31) (рис. ?).
3. Исследование субклеточной локализации изоцитратлиазы выявило, что одна изоформа имеет глиоксисомальную локализацию, а вторая представлена в цитоплазме.
4. Методом ОТ-ПЦР анализа, с использованием вырожденных праймеров к генам изоцитратлиазы, установлено, что в семенах амаранта активно транскрибируются два гена – icl1 и icl2.
5.
6. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени установлена зависимость уровня экспрессии генов изоцитратлиазы от этапов онтогенеза. Максимальный уровень экспрессии генов icl наблюдался на 2-е сутки прорастания (1,53 ед.), минимальный – на 5-е сутки (0,4 ед.). К 9-м суткам наблюдалось незначительное увеличение относительно минимального значения уровня экспрессии (0,7 ед.). Данные значения коррелируют с показателями динамики активности ИЦЛ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ