2.3.2. Изоферментный состав ицл в проростках амаранта

С помощью электрофореза в 8% ПААГ с последующим специфическим окрашиванием на активность изоцитратлиазы был проанализирован её изоферментный состав в семенах исследуемого объекта. В семенах 3х-дневных проростков амаранта было обнаружено две изоформы фермента с различной электрофоретической подвижностью (R_f 0,27 и 0,31) (рис. ?).

Рис. ?. Электрофореграмма ИЦЛ. Специфическое проявление ИЦЛ из 3х дневных проростков амаранта: 1 и 2 – белковые полосы, соответствующие ИЦЛ₁ и ИЦЛ₂; F – фронт красителя.

Также при работе с другими объектами на нашей кафедре были получены аналогичные результаты. Так, в семенах сои и щитках кукурузы так же обнаружены две изоформы изоцитратлиазы с различным значением R_f: 0,28 и 0,44 для сои; 0,25 и 0,29 для кукурузы. В зелёных листьях данных объектов выявлено лишь по одной белковой полосе, причём значения их электрофоретических подвижностей совпадали с медленнодвижущими формами в семенах.

2.3.3. Исследование субклеточной локализации ицл

В проростках амаранта субклеточную локализацию изоцитратлиазы определяли методом дифференциального и изоплотностного центрифугирования, в ходе которого выделили цитоплазматическую, глиоксисомальную, митохондриальную фракции. Как видно из рисунка 5, активность ИЦЛ распределилась по фракциям неравномерно. Наибольшая активность фермента сосредоточена преимущественно в осадке, содержащем грубую фракцию микротелец.

Рис.5. Распределение активности ИЦЛ между фракциями, полученными в результате дифференциального центрифугирования.

Вывод о субклеточной локализации изоцитратлиазы делали на основании равенства:

Е _{кат. пер.} / Е _{кат. цтп} = Е _{ицл пер.} / Е _{ицл цтп} ,

где Е _{кат. пер.} и Е _{ицл пер.} – активности каталазы и ИЦЛ в пероксисомах;

Е _{кат. цтп} и Е _{ицл цтп} – активности каталазы и ИЦЛ в цитоплазме.

Поскольку соотношение активности каталазы и изоцитратлиазы в цитоплазматической фракции и фракции микротелец равно:

1,93 / 6,11 = 2,42 / 7,87 (табл.1).

можно предположить, что обнаруживаемая активность ИЦЛ в цитоплазме является результатом работы другой изоформы исследуемого энзима.

В результате проведённых расчётов было выявлено, что изоцитратлиаза из проростков амаранта имеет две изоформы, одна из которых имеет глиоксисомальную локализацию, а вторая представлена в цитоплазме.

Таблица 1.

Субклеточная локализация ИЦЛ в амаранте после разделения грубой фракции микротелец методом изоплотностного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (n=3, P<0,05)

Фермент	Цитоплазма				Глиоксисомы
	V, мл	Белок, мг	Е	Уд.акт., Е/мгбелка	V, мл	Белок, мг	Е	Уд.акт., Е/мгбелка
ИЦЛ	2	9,44	2,42	0,26	2	4,95	7,87	1,59
Каталаза	2	9,44	1,93	0,21	2	4,95	6,11	1,23