2.2.2.11. Проведение пцр в реальном времени
Для выяснения изменения уровня экспрессии генов icl1 и icl2 амаранта, проводили ПЦР-РВ на приборе DNA Engine® Thermal Cycler «Chromo4» (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green [Tzachi B. Kinetic Outlier Detection (KOD) in real-time PCR / B. Tzachi // Nucleic Acids Research. – 2003. – Vol. 31. – P. 105-109.]. Подбор праймеров осуществляли на основе сравнения нуклеотидных последовательностей генов ИЦЛ с использованием программного обеспечения Primer3 [Rozen S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers / S. Rozen, H. Skaletsky // Methods Mol. Biol. – 2000. – Vol. 132. – P. 365-386.]. Праймеры для ПЦР-РВ анализа были следующими: прямой - 5'-TGYGGNCAYATGGGNGG-3'; обратный - 5'-DCTRCARTTRTANGC-3'.Параметры амплификации: предварительная денатурация при 95оС в течение 5 мин, затем 35 циклов: 95оС – 20 с, 54оС – 20 с, 72оС – 15 с (детекция) и, наконец, финальная элонгация 72оС – 4 мин.
2.2.2.12. Статистическая обработка данных
Опыты проводили в 3 кратной биологической повторности, аналитическое определение для каждой пробы – в трех повторностях. Для определения достоверности результатов применяли метод вариационной статистики. Для построения графиков применяли программы линейной и параболической аппроксимации. При математической обработке использовали статистический критерий Стъюдента.
Из данных исследования (вариант хi) находили среднее арифметическое х (М); затем вычисляли отклонения каждой варианты от среднего значения (хi – х), после чего рассчитывали квадраты отклонения варианты от среднего значения (хi – х)2, затем находили сумму квадратов отклонений Σ (хi – х)2. Далее вычисляли среднее квадратичное отклонение вариант от среднего арифметического (σ) для контроля и опыта по формуле:
,где
n – число вариант.
Затем находили ошибку данных контроля и опыта, после чего рассчитывали нормированное отклонение (t). Значение t, то есть оценка достоверности различий между контролем и опытом, сравнивалась по таблице распределения Стьюдента. Если вычисленное значение совпадает с табличным или больше его, то разницу в эксперименте считали достоверной. Обсуждаются статистически достоверные различия при р≤0,05 [Филлипович Ю.Б. Основы биохимии / Ю.Б. Филлипович. – М.: Высш. шк. 1993.– 496 с.]; [Чернышев Г.А. Вероятность и статистика в биологии и химии / Г.А. Чернышев, В.Н. Стариков – Воронеж: Изд-во ВГУ, 1998. – 270 с.].
2.3. Результаты исследования и их обсуждение
2.3.1. Динамика активности изоцитратлиазы из проростков амаранта
Изучение динамики активности изоцитратлиазы в проростках семян амаранта Amaranthus caudatus L. в течение 10 дней показало, что наблюдается ее индукция с первых дней прорастания, достигающая максимального значения уже на 2-3 сутки (рис.?). Возрастание активности ИЦЛ свидетельствует об активном функционировании глиоксилатного цикла, обеспечивающего конверсию запасных липидов в растворимые формы углеводов. К 10 суткам величина активности ИЦЛ постененно снижалась. В условиях гетеротрофного питания в масличных растениях важную роль играет глюконеогенез, обеспечивающий мобилизацию запасных липидов. Анализ полученных данных по динамике изоцитратлиазной активности показывает корреляцию ее величины от этапа онтогенеза амаранта.
Рис.?. Динамика активности изоцитратлиазы в проростках семян амаранта.