- •Глава 1. Обзор литературы
- •Глава 2. Экспериментальная часть
- •Глава 1. Обзор литературы
- •1.1. Функциональная характеристика изоцитратлиазы и ее роль в регуляции клеточного метаболизма
- •1.1.1. Общая характеристика глюконеогенеза
- •1.1.2. Глюконеогенез в растениях
- •1.1.3. Глюконеогенез у животных
- •1.1.4. Глиоксилатный цикл
- •1.1.4.1. Роль глиоксилатного цикла в глюконеогенезе
- •1.1.4.2.Субклеточная локализация изоцитратлиазы
- •1.1.4.3. Распространение глиоксилатного цикла
- •1.1.4.3.1. Рапространение глиоксилатного цикла у микроорганизмов, низших растений и грибов
- •1.1.4.3.2. Функционирование глиоксилатного цикла у высших растений
- •1.1.4.3.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных
- •1.1.5. Изоферментный состав изоцитратлиазы
- •1.2. Молекулярные аспекты регуляции ицл
- •1.2.1. Экспрессионная регуляция изоцитратлиазы
- •1.2.2. Генетические механизмы регуляции синтеза ицл
- •1.2.3. Характеристика структурной организации генетического материала изоцитратлиазы
- •1.2.4. Эволюция ферментов глиоксилатного цикла
- •1.3. Особенности метаболизма нетрадиционной культуры амаранта
- •1.3.1. Морфо-физиологические и биохимические свойства амаранта
- •1.3.2. Химический состав амаранта
- •Глава 2. Экспериментальная часть
- •2.1. Цель и задачи
- •2.2.2.2. Определение количества белка
- •2.2.2.3. Электрофоретические исследования белков
- •2.2.2.4. Специфическое проявление изоцитратлиазы
- •2.2.2.5. Исследование субклеточной локализации
- •2.2.2.6. Выделение суммарной клеточной популяции рнк
- •2.2.2.7. Проведение обратной транскрипции
- •2.2.2.8. Подбор праймеров
- •2.2.2.9. Проведение полимеразной цепной реакции
- •2.2.2.10. Секвенирование пцр-продукта
- •2.2.2.11. Проведение пцр в реальном времени
- •2.2.2.12. Статистическая обработка данных
- •2.3. Результаты исследования и их обсуждение
- •2.3.1. Динамика активности изоцитратлиазы из проростков амаранта
- •2.3.2. Изоферментный состав ицл в проростках амаранта
- •2.3.3. Исследование субклеточной локализации ицл
- •2.3.4. Идентификация генов изоцитратлиазы
- •2.3.4.1. Выделение суммарной клеточной популяции рнк
- •2.3.4.2. Проведение обратной транскрипции
- •2.3.4.3. Проведение полимеразной цепной реакции
- •2.3.4.4. Определение нуклеотидной последовательности продуктов полученных методом пцр
- •2.3.4.5. Изменение экспрессии генов изоцитратлиазы в проростках амаранта
2.2.2.4. Специфическое проявление изоцитратлиазы
Специфическую идентификацию фермента выявляли с помощью модифицированного реагента Шиффа [Reeves H.C. Determination of isocitrate lyase activity in polyacrylamide gels / H.C. Reeves, M.J. Volk // Anal. Biochem. – 1972. – Vol. 48, № 2. – P. 437-441.].
Методика основана на способности глиоксилата образовывать с модифицированным реагентом Шиффа сильно окрашенное соединение, которое стабильно, достаточно специфично и не сразу диффундирует в гель.
Гели окрашивали путём помещения их в инкубационную среду следующего состава: 50 мМ Трис HCl буфер, рН 7,5; 1 мМ ЭДТА; 3 мМ MgCl2.6Н2О; 3 мМ ДТТ; 10 мМ изоцитрат (трёхнатриевая соль); 1,2 мл модифицированого реагента Шиффа. Гель инкубировали при 37 0С до появления ярко-красной полосы в месте локализации ИЦЛ.
2.2.2.5. Исследование субклеточной локализации
Исследование субклеточной локализации изоцитратлиазы в проростках амаранта проводили с помощью изоплотностного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. После предварительного осаждения неразрушенных остатков тканей и ядер центрифугированием при 1000g в течение 3-4 минут супернатант подвергали дальнейшему центрифугированию в течение ещё 3-4 минут. Полученный супернатант центрифугировали 18 минут при 12000g, а затем – 20-30 минут при тех же оборотах. После этого осадок, растворённый в 10 мл среды выделения, наносили на вершину градиента сахарозы со ступенями 1,3; 1,5; 1,8; 2,3; 2,5 М, уравновешенного 50 мМ Tris-HCl-буфером, содержащим 1 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол и 0,5 мМ ЭДТА. Градиент центрифугировали в течение 2 ч при 100000g. Осадки использовали для определения активности исследуемого фермента. Степень перекрёстного загрязнения органелл определяли по маркерным ферментам. Для пероксисом в качестве маркеров использовали каталазу.
2.2.2.6. Выделение суммарной клеточной популяции рнк
Суммарную клеточную РНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции [Chomczynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction extraction /P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. - 1987. - vol. 162. - pp. 156-159.] со следующими модификациями. Для ингибирования РНКаз на стадии получения клеточного лизата использовали 42,6% гуанидин тиоцианат. Очистку РНК проводили при помощи осаждения хлоридом лития. Качественный анализ препаратов РНК проводили путём неденатурирующего электрофореза в 1% (в/о) геле агарозы при напряжённости электрического поля 7 В/см. Окрашивание геля производилось 0,1% водным раствором бромистого этидия. Визуализация результатов проводилась с использованием трансиллюминатора с длиной волны 312 нм. Результаты фиксировались цифровой видеокамерой Samsung и обрабатывались с помощью пакета программ Gel Explorer 1.0.
2.2.2.7. Проведение обратной транскрипции
Обратную транскрипцию проводили с использованием ревертазы RevertAid M-MuLV (Fermentas, Литва) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Для проведения обратной транскрипции использовали 1 мкг суммарной клеточной РНК. В качестве затравочного использовался олиго-(dT)20 праймер. Для предотвращения деградации матриц РНК в реакционную смесь вносилось 20 ед. ингибитора РНКаз IRNasine.