71

Министерство образования и науки РФ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Воронежский государственный университет»

БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ КЛЕТКИ

Идентификация генов изоцитратлиазы из проростков Amaranthus caudatus L. сорта «Рыжик» и их экспрессия.

Магистерская диссертация

????, биология

Биохимия

Допущено к защите в ГАК

Зав. кафедрой биохимии «_____» А.Т. Епринцев д-р биол. наук проф._._.2013

и физиологии клетки :

Студент: «_____» И. О. Обоймова

Руководитель: «_____» Д.Н. Федорин канд. биол. наук, ассистент

Воронеж 2013

РЕФЕРАТ

УДК.

Обоймова Ирина Олеговна (Идентификация генов изоцитратлиазы из проростков Amaranthus caudatus L. сорта «Рыжик» и их экспрессия)

ВГУ Воронеж 2013.

Содержит ? страниц основного текста, рисунков ?, таблиц ?, ? источника литературы.

ГЛИОКСИЛАТНЫЙ ЦИКЛ, ИЗОЦИТРАТЛИАЗА, ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗ, РНК, кДНК, ПЦР, ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ.

Целью работы является исследование ???. Изучение динамики активности изоцитратлиазы в проростках амаранта Amaranthus caudatus L. в течение 9 дней показало, что она индуцируется с первых дней прорастания и достигает максимального значения уже на 2-3 сутки. Определение изоферментного состава ИЦЛ показало наличие двух изоформ с величинами R_f 0,27 и 0,31. Установлено, что одна изоформа изоцитратлиазы локализуется в глиоксисомальной фракции, а вторая находится в цитоплазме. Проведен ОТ-ПЦР анализ, который показал, что в семенах амаранта активно транскрибируются два гена – icl1 и icl2. ?????????? Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени установлена зависимость уровня экспрессии генов изоцитратлиазы от этапов онтогенеза. Максимум наблюдался на 2-е сутки прорастания (1,53 ед.), минимум – на 5-е сутки (0,4 ед.). К 9-м суткам наблюдалось незначительное увеличение относительно минимального значения уровня экспрессии (0,7 ед.). Данные значения коррелируют с показателями динамики активности ИЦЛ.

Студент И.О. Обоймова

Научный руководитель Д.Н. Федорин

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ – аденозиндифосфат

АМФ – аденозинмонофосфат

АТФ – аденазинтрифосфат

ГДФ - гуанозиндифосфат

ГТФ – гуанозинтрифосфат

ГЦ – глиоксилатный цикл

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ – дитиотрейтол

ДЭАЭ – диэтиламиноэтил

ИЦЛ – изоцитратлиаза

кДНК – комплементарная ДНК

МДГ – малатдегидрогенеза

МС – малатсинтаза

НАД⁺ – никотинамидадениндинуклиотид

ОАА – оксалоацетат

ПААГ – полиакриламидный гель

ПВК – пировиноградная кислота

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени

РНК – рибонуклеиновая кислота

СФ – спектрофотометр

ТЕМЕД - N,N,N',N' - тетраметилэтилен диамин

ФЕП – фосфоенолпируват

ЦС – цитратсинтаза

ЦТК – цикл трикарбоновых кислот

ЭДТА – этилендиаминтетраацетат

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Функциональная характеристика изоцитратлиазы и ее роль в регуляции клеточного метаболизма

1.1.1. Общая характеристика глюконеогенеза

1.1.2. Глюконеогенез в растениях

1.1.3. Глюконеогенез у животных

1.1.4. Глиоксилатный цикл

1.1.4.1. Роль глиоксилатного цикла в глюконеогенезе

1.1.4.2. Субклеточная локализация изоцитратлиазы

1.1.4.3. Распространение глиоксилатного цикла

1.1.4.3.1. Рапространение глиоксилатного цикла у микроорганизмов, низших растений и грибов

1.1.4.3.2. Функционирование глиоксилатного цикла у высших растений

1.1.4.3.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных

1.1.5. Изоферментный состав изоцитратлиазы

1.2. Молекулярные аспекты регуляции ИЦЛ

1.2.1. Экспрессионная регуляция изоцитратлиазы

1.2.2. Генетические механизмы регуляции синтеза ИЦЛ

1.2.3. Характеристика структурной организации генетического материала изоцитратлиазы

1.2.4. Эволюция ферментов глиоксилатного цикла

1.3. Особенности метаболизма нетрадиционной культуры амаранта

1.3.1. Морфо-физиологические и биохимические свойства амаранта

1.3.2. Химический состав амаранта

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ

2.2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1. Объект исследования

2.2.2. Методы исследования

2.2.2.1. Определение активности изоцитратлиазы

2.2.2.2. Определение количества белка

2.2.2.3. Электрофоретические исследования белков

2.2.2.4. Специфическое проявление изоцитратлиазы

2.2.2.5. Исследование субклеточной локализации

2.2.2.6. Выделение суммарной клеточной популяции РНК

2.2.2.7. Проведение обратной транскрипции

2.2.2.8. Подбор праймеров

2.2.2.9. Проведение полимеразной цепной реакции

2.2.2.10. Секвенирование ПЦР-продукта

2.2.2.11. Проведение ПЦР в реальном времени

2.2.2.12. Статистическая обработка данных

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.3.1. Динамика активности изоцитратлиазы из проростков амаранта

2.3.2. Изоферментный состав ИЦЛ в проростках амаранта

2.3.3. Исследование субклеточной локализации ИЦЛ

2.3.4. Идентификация генов изоцитратлиазы

2.3.4.1. Выделение суммарной клеточной популяции РНК

2.3.4.2. Проведение обратной транскрипции

2.3.4.3. Проведение полимеразной цепной реакции

2.3.4.4.Определение нуклеотидной последовательности продуктов полученных методом ПЦР

2.3.4.5. Изменение экспрессии генов изоцитратлиазы в проростках амаранта

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ВВЕДЕНИЕ

Одним из приоритетных направлений развития физиологии и биохимии растений является исследование регуляции метаболических процессов, происходящих в растительном организме. Особый интерес вызывает функционирование важнейшего этапа глюконеогенеза - глиоксилатного цикла, а также изоцитратлиазы (ИЦЛ; КФ 4.1.3.1.) – ключевого фермента в процессе трансформации липидов в доступные для организма формы углеводов.

Изоцитратлиаза имеет широкое распространение в природе и функционирует в различные физиологические периоды жизни у многих организмов. Этот фермент считается большинством авторов маркерным ферментом глиоксилатного цикла [Епринцев А.Т. Глиоксилатный цикл: универсальный механизм адаптации? / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, М.Ю. Шевченко. – М.: ИКЦ «Академкнига» , 2007. – 228 с.], физиологическая роль которого для растений – участие в глюконеогенезе, обеспечивающим растущий организм в условиях гетеротрофного питания доступными формами органического вещества. Однако, в работах А. У. Игамбердиева (1990) сообщалось о наличии второй изоформы, локализованной вне глиоксисом – внеглиоксисомальная форма. Известно так же, что активность изоцитратлиазы увеличивается при старении растения, что даёт возможность преобразовывать липиды в органические кислоты. Таким образом, изоцитратлиаза растений представлена двумя формами, имеющими глиоксисомальную и внеглиоксисомальную локализации.

В последнее время появились сообщения о полифункциональности данной изоферментной системы. Работа данной системы позволяет метаболизировать двухуглеродные соединения, которые токсичны для клетки, и использовать их как строительный материал. В растительном организме в процессе фотодыхательного метаболизма образуется глиоксилат, являющийся токсичным для клетки соединением, но благодаря синтазной реакции ИЦЛ он может использоваться как в катаболических, так и в анаболических реакциях.

Амарант является нетрадиционной сельскохозяйственной продовольственной культурой, относится к С₄-растениям, обладает большим количеством белка, аминокислот, витаминов, макро- и микроэлементов. Также он обладает очень большой засухоустойчивостью и при этом очень хорошо реагирует на полив, что позволяет выращивать его в районах непригодных для традиционных зерновых и зернобобовых культур. Эти особенности делают амарант перспективной культурой, которая может занять свою нишу в сельском хозяйстве. Поэтому исследование в онтогенезе характеристик ферментов, которые регулируют процессы мобилизации жиров, особенно, при смене типов питания, представляет значительный научный интерес.

Исследование отдельных звеньев метаболических процессов, связанных с трансформацией липидов в углеводы, является актуальной задачей не только биохимии, но и молекулярной биологии. В связи с этим целью данной работы являлось выделение из проростков семян амаранта суммарной матричной РНК и идентификация генов, кодирующих изоферменты изоцитратлиазы.