Химические методы исследования

Определение рН рассола. 50 г рассола наливают в пробирку или колбу и выдерживают в водяной бане при температуре 70⁰ С, для свёртывания белков. Затем рассол фильтруют. Определение рН проводят с помощью прибора Михаэлиса или потециометрически так же, как и при исследовании экстракта из солонины.

Рассол свежей солонины имеет рН не более 6,2, солонины сомнительной свежести – 6,3 – 6,8, несвежей – 6,9 и выше.

Реакция на пероксидазу с рассолом. Сущность реакции заключается в том, что находящийся в рассоле фермент пероксидаза разлагает перекись водорода с образованием кислорода, который окисляет бензидин. При это образуется парахинондиимид, который с недоокисленным бензидином даёт нестойкое соединение сине-зелёного цвета, переходящее в бурый.

Порядок выполнения работы. В пробирку отмеряют 2 мл рассола добавляют 5 капель 0,2% спиртового раствора бензидина, перемешивают и вносят 2 капли 1% раствора перекиси водорода.

Рассол доброкачественной солонины окрашивается в сине-зелёный цвет, рассол солонины сомнительной степени свежести окрашивается в сине-зелёный цвет (не явный) с большей задержкой, а в рассоле несвежей солонины сине-зелёное окрашивание не появляется вообще.

Активность пероксидазы зависит от рН среды. С пробами рассола положительная реакция на пероксидазу отмечается при рН до 6,4 – 6,5; при рН рассола 6,6 реакция бывает сомнительной, а при рН 6,7 и выше – отрицательной.

Оценивая степень свежести солонины определяют следующие показатели: количество летучих жирных кислот, наличие первичных продуктов гидролиза белков (реакция с CuSO₄), рН, наличие аммиака, активность пероксидазы и проводят микроскопию мазков – отпечатков.

Определение продуктов первичного распада белков. Метод основан на осаждении белков нагреванием и образованием в фильтрате комплексов сернокислой меди с продуктами первичного распада белков выпадающих в осадок.

Порядок выполнения работы. 20 г измельчённой солонины помещают в коническую колбу вместительностью 100 мл, заливают 60 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают, закрывают часовым стеклом и ставят в кипящую водяную баню, доводят до кипения и кипятят для осаждения белков. Бульон отфильтровывают до прозрачности. В пробирку отмеряют 2 мл фильтрата и добавляют 3 капли 5% раствора сернокислой меди. Содержимое пробирки перемешивают, оценку исследования дают после 5-минутного отстаивания.

Солонина считается свежей, если при добавлении раствора сернокислой меди бульон остаётся прозрачным.

Солонину считают сомнительной свежести, если при добавлении раствора сернокислой меди бульон мутнеет и наблюдается образования невысокого осадка из мелких хлопьев.

Солонину считают несвежей, если при добавлении раствора сернокислой меди бульон становится мутным и образуется желеобразный осадок.

Определение рН. Величина рН солонины изменяется в зависимости от её степени свежести. рН свежей солонины – 5,8 – 6,4, сомнительной свежести – 6,5 – 6,6 и несвежей – 6,7 и выше.

Значение рН солонины можно измерить колориметрическим или потенциометрическим методом.

Колориметрический метод. Для определения рН используют набор Михаэлиса со стандартными цветными растворами в запаянных пробирках, индикаторами и компаратором.

Для проведения исследований готовят вытяжку в соотношении 1:4. Для этого 20 г солонины измельчают, растирают в ступке, добавляют небольшое количество дистиллированной воды из общего объёма 80 мл. Содержимое ступки переносят в колбу, ступку и пестик промывают оставшимся количеством дистиллированной воды и смывную воду переливают в колбу с навеской. Содержимое колбы перемешивают. Вытяжку готовят в течении 15 минут при неоднократном перемешивании содержимого колбы. Затем вытяжку фильтруют и полученный фильтрат используют для исследования.

В начале выбирают рабочий индикатор для этого в фарфоровую чашечку вносят 1 – 2 мл вытяжки и добавляют 1 – 2 капли универсального индикатора. Полученный цвет сравнивают с участками цветной шкалы, имеющейся в наборе. Для работы в кислой среде используют индикатор паранитрофенол, в нейтральной и щелочной – метанитрофенол.

рН определяют при помощи стандартного набора цветных жидкостей, запаянных в пробирках и компаратора с шестью гнёздами для пробирок. В гнёзда компаратора помещают пробирки и заполняют их следующим образом: в 1, 2, 3-ю пробирки 1 ряда вносят по 2 мл фильтрата. В 1 и 3-ю добавляют по 5 мл дистиллированной воды, во 2-ю – 4 мл дистиллированной воды и 1 мл рабочего индикатора. В 5-ю пробирку отмеряют 7 мл дистиллированной воды, в 4 и 6 гнезда помещают стандартные пробирки, цвет жидкости в которых должен быть одинаков с цветом жидкости 2-ой пробирки. рН исследуемого экстракта соответствует цифре указанной на стандартной пробирке.

Потенциометрический метод. Концентрацию ионов водорода можно измерить с помощью рН – метров, погружением двух электродов в раствор с фиксацией значение рН на шкале прибора. Для потенциометрического измерения рН используют лабораторные рН – метры – 340, ЛПУ – 0,1 и др.. На рН – метре – 340 измеряют величину рН от 1 – 14,0.

Метод основан на измерении электродвижущей силы элемента, состоящего из электрода сравнения с известной величиной потенциала и индикаторного (стеклянного) электрода, потенциал которого обусловлен концентрацией ионов водорода в испытуемом растворе.

При помощи рН – метра измеряют разность потенциалов между двумя электродами, помещёнными в раствор. Основой такой системы служит электрод, потенциал которого зависит от рН. Чаще всего в качестве такой рН – зависимой ячейки используют стеклянный электрод, принцип действия которого основан на том, что некоторые типы боросиликатного стекла проницаемы для Н⁺ ионов, но непроницаемы для любых других катионов или анионов. Если тонкий слой такого стекла поместить между двумя растворами с различными концентрациями ионов Н⁺, эти ионы будут диффундировать сквозь стекло из раствора с высокой концентрацией ионов водорода в раствор с низкой концентрацией. Стеклянный электрод содержит 0,1 М раствор соляной кислоты в контакте со стеклом, проницаемым для Н⁺ ионов. К вольтметру его присоединяют проволокой, покрытой хлоридом серебра и погружённый в соляную кислоту (рис_______).

Рис.____. Стеклянный электрод и электрод сравнения: 1-измерительный прибор; 2-элек-трод сравнения; 3- отверстие для заполнения электрода хлоридом калия; 4- каломель (Hg/HgCl2 в насыщенном растворе хлорида калия); 5- кристаллы хлорида ка-лия; 6 – пористая мембрана; 7- раствор; 8- стекло, проницаемое для ионов водорода; 9- 0,1 М раствор соляной кислоты; 10- серебряная проволока, покрытая хлоридом серебра; 11- стеклян-ный электрод.

Цепь замыкается при погружении в раствор электрода сравнения, который чаще всего содержит пасту Hg/HgCl₂ в насыщенном растворе хлорида калия (этот электрод называют каломельным). Ели измерения проводят при высоких температурах, вместо Hg/HgCl₂ используют Ag/AgCl. В обоих случаях хлорид калия служит для создания контакта между Hg/HgCl₂ или Ag/AgCl – полуэлементом и раствором, в котором проводят измерения. Такой полуэлемент помещают в стеклянный корпус, непроницаемый для Н⁺ ионов (его потенциал не зависит от рН). Электрический контакт между раствором хлорида калия внутри электрода сравнения и измеряемым раствором осуществляется с помощью тон-кой нити или капилляра в стеклянном кор-пусе. Напряжение, измеряемое такой сис-темой, является прежде всего разновид-ностью потенциалов между стеклянным электродом и электродом сравнения.

Порядок выполнения работы. рН солонины определяют в водной вытяжке, приготовленной в соотношении 1:10. Смесь настаивают 30 мин. при периодическом перемешивании и фильтруют через бумажный или ватный фильтр. рН крови измеряют после разведения её водой в соотношении 1:5 или 1:8, рН белка яйца – в соотношении 1:4.

Прибор проверяют и настраивают по стандартным буферным растворам. Измерение рН на рН-метре-340 проводят в следующей последовательности. Прибор включают в сеть и после 60 – минутного прогревания (непосредственно перед измерением рН) проверяют и настраивают его по стандартным буферным растворам с разными рН. При этом переключатель «размах» устанавливают в положение 15 рН, переключатель температуры – на значение температуры буферного раствора.

Температура исследуемого и стандартных буферных растворов должна быть одинаковой. В случае измерения рН растворов, температура которых непрерывно меняется, рекомендуется применять автоматическую компенсацию. Затем стеклянный электрод и электрод сравнения погружают в буферный раствор, осторожно перемешиваемый для приведения системы в равновесие. Переключатель «предел измерений» устанавливают в положение, соответствующее диапазону рН измеряемого буферного раствора, и проверяют показания прибора в диапазонах: для буферного раствора с рН 1,1 на диапазоне измерений рН 1,0 – 2,0, с рН 4,0 на диапазоне рН 2,0 – 5,0, с рН 6,8 на диапазоне рН 5,0 – 8,0 и с рН 9,22 на диапазоне рН 8,0 – 11,0. показания рН – метра должны соответствовать рН буферных растворов. Отсутствие такого соответствия указывает на нарушение изоляции или повреждение электрода (трещины или царапины в мембране). Показания на широком диапазоне измерений (от 1,0 до 14,0) отсчитывают по нижней шкале прибора. Показания на узких диапазонах отсчитывают по верхней шкале, переключив ручку переключателя из положения 15 рН в положение 3 рН (только на время отсчёта показаний). По шкале прибора рН фиксирует после того, как показания примут установившееся значение. Для установления показаний обычно необходимо не более 3 мин.

После проверки прибора по буферному раствору в сосуд для электродов помещают испытуемый раствор, погружают электроды и по верхней шкале отсчитывают показания приборов.

Примечание. В нерабочем состоянии электроды должны быть погружены в дистиллированную воду или 0,1 М раствор соляной кислоты, поскольку высыхание их приводит к изменению потенциала и изнашиванию поверхности электрода. Проточный хлорсеребряный электрод всегда должен быть погружен в насыщенный раствор хлорида калия. Новые электроды перед работой выдерживают в течении нескольких часов в дистиллированной воде. Рекомендуется также активизировать электроды, выдерживая их в 0,1 М растворе соляной кислоты в течении 12 – 24 ч, после чего промыть дистиллированной водой. Перед каждым погружением в раствор электроды промывают дистиллированной водой, а остаток воды на поверхности удаляют фильтровальной бумагой. Не следует допускать длительного пребывания электродов в концентрированных кислотах и щелочах. В электрод сравнения периодически добавляют насыщенный при комнатной температуре раствор хлорида калия.

Реакции на пероксидазу. Для постановки этой реакции используют профильтрованную вытяжку, приготовленную в соотношении 1:4, активность пероксидазы определяют по общепринятой методике (см. исследование рассола). Вытяжка из свежей солонины окрашивается в сине-зелёный цвет в течение первой минуты, в сомнительных случаях слабое позеленение наступает в течение 1 – 2 минут и сразу же переходит в буро-коричневый цвет. Цвет вытяжки из несвежей солонины, после внесения реактивов, не изменяется или сразу приобретает коричневый цвет.

Определение сероводорода. Навеску солонины массой 20 г измельчают, помещают в широкую пробирку. На полоску фильтровальной бумаги наносят каплю 10%-ного щелочного раствора уксуснокислого свинца, диаметр капли должен быть не более 4 – 5 мм. Полоску бумаги закрепляют пробкой так, чтобы нижняя её граница находилась на середине пробирки. Пробирку помещают в водяную баню при температуре 50-55⁰ С на 15 мин. Затем извлекают полоску и читают реакцию.

Если солонина свежая, то капля не окрашивается или становится слабо-бурого цвета, при исследовании солонины сомнительной свежести капля окрашивается в буро-коричневый цвет, несвежей солонины – в тёмно-коричневый.

Определение аммиака (по Эберу). Необходимо приготовить реактив Эбера. Для этого берут 1 часть концентрированной соляной кислоты, 1 часть эфира и 3 части этилового спирта. Основной реагент — хлористый водород; эфир способствует быстрому испарению жидкости. Газообразный аммиак, выделяющийся из продукта, соединяется с хлористым водородом, образуя нашатырь (белое облачко).

Нельзя исследовать охлажденные продукты, так как возможна конденсация воды и появление ложного облачка.

Порядок выполнения работы. В пробирку наливают 1 мл реактива Эбера. Пробирку встряхивают и закрывают пробкой с пропущенной через неё проволочкой или стеклянной палочкой, заканчивающейся крючком. На крючок надевают маленький кусочек исследуемой солонины. Расстояние между кусочком солонины и поверхностью реактива должно быть приблизительно 1 см. При наличии в солонине газообразного аммиака в пробирке появляется белое облако нашатыря. Облачко более заметно при движении палочки вверх и вниз, особенно в момент извлечения кусочка продукта из пробирки.

Интенсивность реакции отмечают следующим образом: отрицательная или слабо положительная — быстро исчезающее облачко, появляющееся в момент извлечения кусочка продукта из пробирки; положительная — устойчивое облачко, появляющееся через несколько секунд после внесения кусочка в пробирку с реактивом; резко положительная — облачко появляется при внесении кусочка в пробирку.

Бактериоскопия. Мазки-отпечатки готовят по общепринятой методике. При бактериоскопии оценивают густоту окрашивания препарата, а также определяют количественный и качественный состав микрофлоры.

Мазки-отпечатки из доброкачественной солонины или солено-копченых мясных изделий окрашиваются слабо. В одном поле зрения препарата из поверхностного слоя обнаруживают единичные микробные тела, преобладают кокки; в мазках из глубоких слоёв микроорганизмы отсутствуют.

Мазки из продукта сомнительной свежести окрашиваются более отчётливо. В поле зрения препаратов из поверхностных и глубоких слоев находят 10 - 20 палочек и кокков.

При недоброкачественности продукта мазки окрашиваются густо, в поле зрения находят более 20 микроорганизмов, преимущественно палочек.