2.3. Пространственная динамика роста сгустка в неперемешиваемой плазме крови.

В лаборатории физической биохимии системы крови Гематологического научного центра РАМН предложена [43, 61] оригинальная постановка эксперимента по исследованию пространственной динамики роста сгустка в неперемешиваемой плазме крови. Пространственные закономерности роста сгустка и распределения тромбина в тромбе и его окрестностях изучаются в тонком слое плазмы крови, налитой в чашку Петри. Свертывание может быть инициировано как по внутреннему, так и по внешнему путям.

При инициации внутреннего пути стеклянным шариком, горкой коллагена или тромбина, а так же при активации внешнего пути кусочком стенки кровеносного сосуда наблюдается радиальная симметрия сгустка [61]. Сгусток, как и в гомогенных системах, начинает расти не сразу, а через некоторое время после активации свертывания (5-10 минут при активации стеклом). Наблюдается как бесконечный рост сгустка, так и рост его с постоянной скоростью и последующей резкой остановкой, причем для самых различных по природе активаторов размер получающегося сгустка и скорость роста (50-100 мкм/мин) оказываются примерно одинаковым и слабо зависящим от силы активатора. Контрольные эксперименты с цельной кровью показали, что конечные размеры сгустков в крови и в плазме одинаковы. Использованием субстрата тромбина (BOC-Ala-Pro-Arg-AMC, где ВОС - t-N-бутоксикарбонил, AMC - остаток 4-метил-7-аминокумарина), продукт которого (АМС, 4-метил-7-аминокумарин) обладает флуоресценцией, показано, что распределение АМС при образовании сгустка совпадает по размерам с формирующимся фибриновым сгустком. Большая часть экспериментов в этих работах проводилась в бедной тромбоцитами плазме, однако, скорость роста сгустка (измеренная по профилям флуоресценции АМС) заметно не менялась при повышении концентрации тромбоцитов (свободная от тромбоцитов, бедная тромбоцитами и богатая тромбоцитами плазмы). Этот результат показывает, что присутствие тромбоцитов слабо влияет на динамику пространственного образования сгустка в данной экспериментальной постановке. Однако в богатых тромбоцитами плазмах наблюдался более быстрый спонтанный зарост (спонтанное образование сгустков в различных местах чашки Петри в различное время вне зависимости от активатора), нежели в бедных.

Также было найдено предсказанное теоретически (по автоволновой и механизменной моделям, см. п. 3.2.4) формирование растущим сгустком кольцевых структур, состоящих из чередующихся полос свернувшейся и несвернувшейся плазмы (слоистые тромбы).

В другой постановке эксперимента [43] инициация внешнего пути свертывания производится приведением исследуемой плазмы или цельной крови в контакт с полиэтилентерефталатовой (ПЭТ) пленкой, несущей на себе монослой экспрессирующих тканевой фактор культуры фибробластов (инициация внешнего пути, а внутренний путь блокируется ингибитором корнтрипсином), либо ПЭТ пленкой без клеток или торцом предметного стекла (инициация внутреннего пути). Обычно используется клеточная линия фибробластов легких эмбриона человека. В этой постановке стала возможной регистрация профилей светорассеяния от фибрина через равные промежутки времени, математическая обработка профилей и получение зависимости скорости роста сгустка от времени. Характерная кинетика роста сгустка в норме и при гемофилиях представлена на рис. 3. Видно, что распространение фронта свертывания от активатора начинается с некоторой задержкой и, через некоторое время, скорость роста обычно выходит на стационарное значение. При этом остновка роста тромба практически никогда не наблюдается.

В табл. 2 представлены основные характеристики свертывания, полученные в описанной постановке. Следует обратить внимание на: 1) слабую зависимость скорости роста сгустка от типа активатора; 2) корреляцию времени инициации свертывания с характером активации (как в гомогенных системах, активация по внетреннему пути приводит к большему лаг-периоду, чем активация по внешнему); 3) уменьшение скорости роста при гемофилиях и близость параметров роста для гемофилий А и В. То, что время инициации свертывания в пространственной постановке значительно больше, чем в гомогенной, неудивительно, т.к. в гомогенных тестах используются значительные количества активатора (заведомый его избыток), и площадь активирующей поверхности в тестовых системах получается огромной.

Таблица 2. Основные характеристики свертывания в нормальной плазме и плазме больных тяжелой формой гемофилий А и В [43]. Средние значения±стандартное отклонение, в скобках указано число плазм.

Активатор	Параметр	Доноры	Гемофилия А	Гемофилия В
Стекло	Время инициации свертывания (мин)	6.5 ± 2 (n=18)	35 ± 20 (n=19)	20 ± 5 (n=5)
	Скорость роста сгустка (мкм/мин)	50 ± 12 (n=17)	12.2  6.3 (n=11)	11.4 ± 7.2 (n=6)
	Размер сгустка на 40-й минуте (мм)	1.72  0.25 (n=7)	0.79  0.18 (n=3)	0.52  0.24 (n=4)
ПЭТ пленка	Время инициации свертывания (мин)	10 ± 3 (n=17)	47 ± 21 (n=17)	41 ± 1 (n=2)
	Скорость роста сгустка (мкм/мин)	49 ± 14 (n=14)	12.8 ± 6 (n=8)	2.4 ± 3 (n=2)
	Размер сгустка на 40-й минуте (мм)	1.50  0.36 (n=7)	0.24  0.08 (n=3)	0.03  0.04 (n=4)
Монослой фибробластов (~1000..1500 кл/мм2)	Время инициации свертывания (мин)	<1	<1	<1
	Скорость роста сгустка (мкм/мин)	48 ± 5 (n=14)	14.9 ± 4.3 (n=27)	9.5 ± 1.8 (n=5)
	Размер сгустка на 40-й минуте (мм)	1.74  0.27 (n=7)	0.90  0.12 (n=3)	0.74  0.15 (n=4)
Каолин	АЧТВ (сек)	33.6  3.8 (n=7)	90.7  21.0 (n=5)	73.1  14.3 (n=5)
Тромбопластин	ПВ (сек)	16.1  0.6 (n=7)	16.3  0.4 (n=5)	16.2  0.5 (n=5)

Рис 3. Зависимость размера сгустка от времени в нормальной и гемофилической плазмах [43].

Эти экспериментальные данные находятся в хорошем соответствии с гипотезой о том, что кинетика роста сгустка определяется распространением бегущей от активатора волны активных факторов свертывания. Предложенный экспериментальный подход является удобным инструментом для исследования пространственной динамики роста сгустка, а измеряемые в такой постановке характеристики образующегося фибринового сгустка дают существенную информацию о роли различных реакций на разных этапах свертывания и о механизме нарушения свертывания при дефицитах факторов внутреннего пути.

Математические модели, построенные в той же лаборатории и рассматриваемые ниже, в разделах 3.2 и 3.3, количественно согласуются с экспериментальными данными в пределах точности эксперимента и служат хорошей теоретической базой только что описанного экспериментального подхода.