- •Оглавление.
- •V. Выводы. 70
- •Введение.
- •I. Обзор литературы.
- •1. Гемостаз.
- •1.1. Плазменная система свертывания крови.
- •1.1.1. Состав, каскадная структура.
- •1.1.2. Сборка мебранных комплексов внутреннй теназы и протромбиназы.
- •1.2. Нарушения свертывания крови.
- •2. Экспериментальные исследования свертывания in vitro.
- •2.1. Стандартные гомогенные тесты.
- •2.2. Исследование пространственных эффектов в гомогенной постановке.
- •2.3. Пространственная динамика роста сгустка в неперемешиваемой плазме крови.
- •3. Математические модели плазменного звена свертывания крови.
- •3.1. Модели свертывания, основанные на каскадном устройстве системы и описывающие ее на качественном уровне.
- •3.1.1. Открытый ферментативный каскад.
- •3.1.2. Каскад с утечкой.
- •3.1.3. Учет положительных обратных связей через кофакторы.
- •3.1.4. Модельные ферментативные каскады.
- •3.2. Детальные, количественные модели свертывания.
- •3.2.1. Гомогенное тромбообразование.
- •3.2.2. Тромбообразование в ространственно-распределенной системе.
- •3.2.3. Механизменная модель свертывания крови в системе без перемешивания.
- •3.2.4. Феноменологическая автоволновая модель тромбообразования в системе без перемешивания.
- •3.3. Описание исходной модели.
- •II. Методы.
- •1. Методы численного решения уравнений.
- •2. Программа для расчета.
- •III. Результаты.
- •1. Уточнение исходной модели
- •1.1. Роль редуцированных ранее переменных – концентраций мембранных комплексов.
- •1.2. Учет реакций активации факторов IX и X фактором viIa.
- •1.3. Варьирование константы активации фактора XI тромбином.
- •2. Первоначальное упрощение исходной модели.
- •3. Вклад диффузионных членов в динамику поведения системы.
- •4. Редукция факторов VII и viIa. Введение новых переменных.
- •5. Аппроксимация формы бегущих импульсов факторов viiIa, Va и xIa.
- •5.1. Аппроксимация формы бегущего импульса фактора viiIa.
- •5.2. Распространение подхода на факторы Va и xIa.
- •6. Вклад диффузии мембранных комплексов и переход к концентрации свободного фактора Xa.
- •7. Верификация редуцированной модели.
- •IV. Обсуждение результатов.
- •1. Реальная размерность системы.
- •2. Характер поведения системы на различных стадиях свертывания.
- •3. Численное решение диффузионной задачи.
- •4. Упрощение алгебраических выражений в кинетических уравнениях.
- •5. Нормировка концентраций факторов.
- •6. Применение теоремы Тихонова к системе уравнений вида “реакция-диффузия”.
- •7. Смысл переменной е.
- •8. Аппроксимация формы бегущих импульсов факторов viiIa, Va и xIa.
- •9. Редукция блока внешней теназы.
- •V. Выводы.
- •Приложение а. Исходная модель.
- •Приложение б. Уточнение и упрощение исходной модели.
- •Приложение в. Упрощенная исходная модель.
- •Приложение г. Нормированная система.
- •Приложение д. Редуцированная модель.
- •Список литературы.
2. Экспериментальные исследования свертывания in vitro.
2.1. Стандартные гомогенные тесты.
В клинической практике широко используются стандартные гомогенные лабораторные тесты (активированное частичное тромбопластиновое время, АЧТВ; тест Квика, или протромбиновое время, ПВ; тромбиновое время, ТВ), которые позволяют выявить патологии плазменного звена свертывания и вместе достаточно полно характеризуют общую свертывающую способность плазмы [5,7], хотя не очень чувствительны к состояниям гиперкоагуляции и болезням с мягкой кровоточивостью. В этих тестах плазма инкубируется со стандартизованным инициатором свертывания, и регистрируется только один параметр - время образования сгустка. Активируется либо внутренний путь свертывания (АЧТВ, активация измельченным оксидом кремния или каолином, содержащим в-основном каолинит H4Al2Si2O9), внешний путь (ПВ, активация тромбопластином – водным экстрактом тканей, обычно мозговой, легочной или плацентарной, т.к. они содержат много тканевого фактора) , или конечный этап свертывания (ТВ, превращение фибриногена в фибрин под действием стандартизованного хроматографически очищенного тромбина). Тест АЧТВ чувствителен к дефицитам факторов внутреннего и общего путей свертывания (т.е. всех факторов свертывания, кроме факторов VII, VIIa), ПВ – внешнего и общего путей (факторы VII, X, V, II), ТВ – к концентрации фибриногена и продуктов деградации фибрина.
Одним из самых информативных на сегодняшний день методов исследования коагуляционной способности системы свертывания крови является регистрация кинетики образования ключевого фермента свертывания – тромбина (тромбограммы). Для этого можно использовать специфичные хромогенные (для дефибринированной плазмы) или флуорогенные (для плазмы и крови) субстраты тромбина. Так как добавление большого количества субстрата, требуемое для регистрации кинетики его расходования, приводит к сильному конкурентному ингибированию тромбина, то действуют следующим образом. В процессе свертывания крови (плазмы) из нее отбирают аликвоты, в них добавлением избытка ЭДТА, который связывает ионы Ca2+, останавливают свертывание, проводят центрифугирование, добавляют субстрат и регистрируют интенсивность флюоресценции, которая пропорциональна количеству тромбина [33]. Недостаток метода состоит в его трудоемкости и в том, что за время центрифугирования часть тромбина ингибируется антитромбином, что приводит к заниженым результатам. В случае непрерывной регистрации кинетики расходования субстрата (по кинетике накопления продукта его расщепления, [35]), кинетическая кривая тромбина вычисляется дифференцированием кинетической кривой продукта.
Более точным методом является регистрация кинетики образования тромбин-антитромбинового комплекса (ТАТ, [17]). После отбора аликвот в них добавляется мощный ингибитор, который мгновенно связывает весь тромбин. После центрифугирования измеряют концентрацию ТАТ.
Было показано, что кинетика тромбина в активированной тромбопластином или каолином плазме имеет вид импульса, который принято характеризовать лаг-периодом, максимальной концентрацией тромбина и площадью под его кинетической кривой (тромбиновым потенциалом, ТП). Такая же кинетика тромбина наблюдается в очищенных системах и в цельной крови. При активации внешнего пути лаг-период мал, а при активации внутреннего пути – гораздо более длительный (то же наблюдается и в тестах АЧТВ и ПВ). Полное свертывание плазмы (образование сгустка) происходит при появлении уже 5-10% от максимальной концентрации тромбина. Поэтому длительность лаг-периода практически эквивалентна времени свертывания. Дефициты факторов свертывания приводят к удленению лаг-периода и к уменьшению максимальной концентрации тромбина и тромбинового потенциала, поэтому по тромбограмме можно судить о состоянии плазменного звена системы свертывания.
Однако, гомогенные тесты оставляют неясмыми ряд вопросов. Во-первых, если полное свертывание происходит уже при появлении небольших количеств тромбина, то какова роль тромбина, появляющегося после этого момента? Во-вторых, тромбограмма гемофильных больных хоть и имеет пролонгированный лаг-период и уменьшенные ТП и максимум тромбина, но свертывание в такой постановке все же происходит полностью, т.к. для полного превращения всего фибриногена в фибрин достаточно очень небольших количеств тромбина. Как это связать с кровоточивостью при гемофилиях? На эти вопросы можно ответить, вспомнив о том, что in vivo свертывание крови – принципиально пространственный процесс, включающий в себя зарождение, рост и остановку роста фибринового сгустка. Очевидно, что скорость роста сгустка будет тем больше, чем больше концентрация активных факторов свертывания, так как распространение активных факторов происходит диффузионно. Поэтому “избыточное” в гомогенных постановках образование активных факторов, и, в частности, тромбина, в пространственно-рапределенной системе таковым, вероятно, не является. Более того, можно ожидать, что тромбообразование в пространственно-распределенной системе должно довольно сильно отличается от такового в гомогенной, и для его полного понимания гомогенных тестов недостаточно.