1.1. Плазменная система свертывания крови.

1.1.1. Состав, каскадная структура.

Коагуляционное (плазменное) звено системы гемостаза обеспечивает свертывание плазмы крови: образование защитного сгустка непосредственно в месте повреждения стенки сосуда. Свернувшаяся плазма, или сгусток, представляет собой гель - полимерную сеть фибрина, и составляет основу гемостатического тромба. Кроме фибрина, в сгусток оказываются вовлечены клетки крови, в первую очередь - эритроциты и тромбоциты, и поэтому он окрашен в красный цвет.

Рис. 1. Упрощенная схема современных представлений о каскаде свертывания

Таблица 1. Средние плазменные концентрации основных факторов свертывания (по [1]).

Название	Концентрация, нМ	Название	Концентрация, нМ
Фибриноген	8800	Фактор XII	375
Фактор II	1400	Прекалликреин	450
Фактор V	20	HK	6000
Фактор VIIa	0.1	Фактор XIII	70
Фактор VII	10	Протеин C	60
Фактор VIII	0.7	Протеин S	300
Фактор IX	90	TFPI	2.5
Фактор X	170	Антитромбин III	3400
Фактор XI	30

Система свертывания является каскадом протеолитических реакций, в котором участвуют тринадцать белков - факторов свертывания крови (рис. 1, табл. 1), а также множество других белков, не называющихся факторами (протеины C, S, Z, ингибиторы и др.). Неактивные факторы обозначаются римскими цифрами, активные - теми же цифрами с буквой а. Принятый в мировой практике порядок обозначений факторов отражает историческую последовательность открытия белков. Кроме обозначения римскими цифрами, каждый фактор, кроме II, IIa, I и Ia – протромбина, тромбина, фибриногена и фибрина,– имеет именное название по имени человека, у которого впервые был обнаружен дефицит этого фактора, а у многих факторов есть и неименные названия: фактор VIII - антигемофильный глобулин, фактор V – проакцелерин и т.д. В настоящий момент именная система обозначений практически не используется.

Большинство активированных факторов свертывания являются сериновыми протеазами (факторы XIIa, XIa, IXa, Xa, IIa, VIIa и прекалликреин) или кофакторами (факторы Va, VIIIa и высокомолекулярный кининоген, ВМК). Исключение составляют лишь фактор XIIIa, который является трансглутаминазой, тканевый фактор (TF) – кофактор/рецептор, и фибрин. Сериновые протеазы – это ферменты, осуществляющие гидролиз пептидной связи в молекуле белка. Ключевым моментом механизма их действия является нуклеофильная атака сорбированной молекулы субстрата гидроксильной группой остатка серина (рис. 2). При их образовании от молекулы зимогена отщепляется небольшой пептидный фрагмент, в результате чего активный центр фермента “обнажается”, становится доступным для субстратов [2].

Рис 2. Принципиальная схема работы сериновой протеазы [4].

Активация плазменного звена свертывания может происходить двумя путями, которые принято называть внешним и внутренним путем.

Внешний путь запускается при повреждении клеток эндотелия сосуда, в результате чего в плазму поступает тканевый фактор (TF) – интегральнай трансмембранный белок, имеющийся во всех без исключения тканях организма, в том числе во многих клетках, в норме имеющих контакт с кровью, за исключением мембран клеток эндотелия сосудов и клеток крови [2]. Особенно много тканевого фактора в тканях мозга [5]. В присутствии ионов кальция на поверхности мембран, содержащих TF, происходит сборка комплекса TF с фактором VIIa; этот комплекс называется внешняя теназа (Extrinsic Xasa). Внешняя теназа обладает высокой протеолитической активностью по отношению к факторам IX и X.

В норме в кровотоке постоянно циркулирует небольшое количество фактора VIIa (0.1 нМ, или 1% от неактивированного фактора VII). Фактор VII может активироваться за счет довольно слабого протеолитического действия других сериновых протеаз свертывания (тромбина, факторов IXa, Xa, XIIIa), а также за счет самоактивации. Самыми сильными активаторами фактора VII являются фактор Xa и тромбин [22]. Вероятно, роль тромбина наиболее велика вследствие его высокой концентрации, достигаемой при свертывании.

Внутренний путь активации свертывания крови определяется как коагуляция, инициируемая компонентами, полностью находящимися в пределах сосудистой системы [2]. Это может быть любая отрицательно заряженная поверхность, например, коллаген, вступающий в контакт с кровью при отшелушивании клеток эндотелия. Активацию внешнего пути также может инициировать любая чужеродная поверхность, несущая отрицательный заряд, – заноза, лабораторная посуда. Сильным активирующим действием обладает стекло, т.к. его поверхность отрицательно заряжена. Поэтому стеклянную лабораторную посуду перед использованием силиконируют [5].

Активация внутренного пути начинается с адсорбции фактора XII на отрицательно заряженную поверхность (контактная активация). Этот фактор становится активным в результате конформационных изменений, происходящих при адсорбции. Система контактной активации свертывания довольна сложна и содержит, кроме фактора XII, также активируемый поверхностью кофактор кининоген высокой молекулярной массы (ВМК) и профермент прекалликреин; ее элементы объединены рядом положительных обратных связей (рис. 1). В результате работы системы контактной активации образуются большие концентрации фактора XIIa, который активирует фактор XI. Вслед за этим происходит последовательная активация факторов IX, X и протромбина. Контактная активация, кроме системы свертывания, участвует также в запуске системы фибринолиза.

Каскад свертывания охвачен петлями положительных и отрицательных обратных связей. Положительные обратные связи реализуются через активацию фактора VII факторами Xa и IIa (тромбином), факторов V, VIII и XI тромбином, а также в блоке реакций контактной активации (рис.1). Факторы IXa и Xa образуют на прокоагулянтной поверхности комплексы с кофакторами VIIIa и Va, соответственно (внутренняя теназа и протромбиназа), активность которых на 4-5 порядков выше активности свободных ферментов. Усилительный эффект, возникающий в результате функционирования петель положительной обратной связи, настолько высок, что каскад системы свертывания можно рассматривать даже не как усилитель внешнего (активирующего) сигнала, а скорее как триггерный механизм, очень быстро переводящий кровь из жидкого состояния в гель [61].

Желеобразное состояние свернувшейся плазмы достигается за счет образования трехмерной полимерной сети фибрина. Для этого необходимы два фермента: тромбин и фактор XIIIa. Тромбин отщепляет от длинной молекулы фибриногена 2 олигопептида, при этом образуются мономеры фибрина, состоящие из трех доменов: D-E-D. Мономеры фибрина связываются друг с другом (гидрофобные, Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия и водородные связи) доменами D, домен E третьей молекулы мономера фибрина усиливает это соединение. Так образуются разветвленные волокна растворимого фибрина (фибрина S), пространственная сеть. Далее фактор XIIIa, получающийся из XIII под действием тромбина, производит поперечные сшивки между близкорасположенными молекулами фибрина. Теперь фибриновый каркас преобредает устойчивость к действию фибринолитической системы (которая запускается одновременно с системой свертывания и легко разрушает полимерные сети растворимого фибрина).

Для обеспечения устойчивого стационарного неактивированного состояния и для уничтожения активных факторов после завершения свертывания в системе присутствуют многочисленные стехиометрические ингибиторы, которые связываются с активными факторами и ингибируют их деятельность. Ключевыми среди стехиометрических ингибиторов являются антитромбин III и ингибитор пути тканевого фактора, TFPI [16]. Первый из них блокирует активность тромбина, факторов IXa, Xa, XIa, VIIa. Дефицит его приводит к тромбозам. Второй связывается с фактором Xа и внешней теназой, ингибируя обе протеазы и являясь основным регулятором активности комплекса VIIa–TF [8, 11]. Дефицит TFPI в клинике не наблюдался, предположительно, из-за несовместимости с жизнью [12]. Детальный механизм действия TFPI до конца не установлен, но хорошо известно, что важной его стадией является связывание TFPI с Xa фактором, в отсутствие которого ингибирования не происходит [9, 10].

В значительно меньшей степени, нежели антитромбином III, тромбин ингибируется кофактором гепарина II и альфа-2-макроглобулином [16]. Некоторый вклад в ингибирование различных протеаз каскада свертывания вносят также альфа1-антитрипсин, С1-ингибитор и ингибитор протеина С [13].

Каскад охвачен петлей отрицательной обратной связи, так называемым путем протеина С (pC) [15]. Будучи активирован тромбином, протеин C инактивирует факторы Vа и VIIIа, резко снижая скорость образования тромбина и фактора Xа, соответственно. Кофактором в этом расщеплении служит протеин S, важный антикоагулянт, присутствующий в плазме. Кроме того, что он ускоряет реакции инактивации, он помогает активированному протеину С (pCa) расщепить фактор Va в составе протромбиназы, чего в его отсутствие не происходит [18]. Кроме того, протеин S обладает независимым от протеина С механизмом антикоагулянтного действия, предположительно, за счет конкуренции с протромбиназой и теназой за место на мембране [14].

In vivo большое значение имеет влияние стенок сосудов на свертывающую систему крови. Сосудистая стенка принимает непосредственное участие в регуляции потенциала свертываемости крови. Помимо того, что она служит естественным барьером между кровью и другими тканями, ее клетками синтезируются и/или экспрессируются различные биологически активные вещества, модулирующие тромбообразование. К ним относится фактор Виллебранда, эндотелиальный фактор релаксации (NO), простациклин, тромбомодулин, эндотелин, тканевый фактор, ингибитор пути тканевого фактора и другие [2, 6]. Кроме того, мембраны эндотелиоцитов несут на себе рецепторы, которые при определенных условиях связывают молекулярные лиганды и клетки, свободно циркулирующие в кровотоке. Очень многие аспекты жизнедеятельности этих клеток регулируются тромбином через его взаимодействие со специфическими поверхностными рецепторами. В норме стенки обладают ярко выраженной антитромботической активностью, механизмы которой не вполне ясны. Известно, что с их поверхностью постоянно связано большое количество антитромбина III, а также TFPI, полное содержание последнего на стенках по меньшей мере не уступает содержанию в плазме [12]. На поверхности клеток эндотелия содержится трансмембранный белок тромбомодулин, связывающий тромбин и производящий резкое изменение его специфичности: в комплексе с тромбомодулином тромбин в значительной степени теряет свою прокоагулянтную силу (сильно уменьшается его активность по отношению к фибриногену, факторам V, VIII и XI), но резко возрастает его сила как антикоагулянта, т.к скорость активации им pC возрастает на три-четыре порядка [19]. По всей видимости, перечисленные свойства сосудистой стенки играют важную роль в механизме локализации тромба in vivo.