- •Введение
- •Трансгенные мыши: методология
- •Использование ретровирусных векторов
- •Метод микроинъекций днк
- •Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток
- •Электропорация.
- •Биобаллистическая трансформация.
- •Липофекция (2-я модель).
- •Клонирование с помощью переноса ядра
- •Перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом
- •Трансгенные мыши: применение
- •Трансгенный крупный рогатый скот
- •Трансгенные овцы, козы и свиньи
- •Трансгенные птицы
- •Трансгенные рыбы
- •Заключение
- •Список использованной литературы
Перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом
Хромосомы высших организмов содержат в своем составе протяженные молекулы ДНК. Например, длина ДНК одной из типичных хромосом человека составляет 100–200 миллионов пар оснований (м.п.о.). Исследование генов в хромосомах высших растений, животных и человека потребовало создания векторов для клонирования фрагментов ДНК длиной в несколько сотен тысяч пар оснований. Этим задачам отвечает недавно созданная система для клонирования сверхдлинных молекул ДНК на основе искусственно полученной мини-хромосомы дрожжей YAC (yeast artificial chromosome). YAC-вектор представляет собой кольцевую молекулу ДНК, содержащую ряд генетических элементов, которые позволяют ей существовать во внехромосомном состоянии в клетках дрожжей (рис. 9).
Вектор заключает в себе две теломерные последовательности нуклеотидов TEL, необходимые для репликации концов мини-хромосомы, и область начала репликации ARS1, соединенную с последовательностью центромеры. Все эти функциональные элементы требуются для репликации YAC-вектора и его правильной передачи в дочерние ядра во время митоза. Кроме того, вектор содержит два селектируемых маркера TRP, восстанавливающих способность к росту ауксотрофных по триптофану клеток дрожжей в отсутствие экзогенного триптофана, а также маркер URA3, компенсирующий генетический дефект клеток дрожжей, который нарушает биосинтез урацила. В векторе имеется также ген супрессорной тРНК sup4, являющийся селектируемым маркером для поддержания вектора в мутантных бактериальных клетках, содержащих амбер-мутации в жизненно важных генах. Помимо этого, он обладает последовательностями нуклеотидов, необходимыми для его репликации в бактериальных клетках.
При подготовке к клонированию YAC-вектор, выделенный в виде плазмиды, расщепляют рестриктазой BamHI и отделяют от образовавшегося короткого фрагмента ДНК, который не требуется для репликации YAC-вектора в дрожжах (этап 1). После этого проводят второе расщепление вектора рестриктазой EcoRI, сопровождающееся образованием двух его "плеч", каждое из которых на одном из концов содержит теломерные последовательности хромосомы дрожжей (этап 2). На заключительном этапе (3) полученные "плечи" лигируют с крупными EcoRI-фрагментами клонируемой ДНК, которые получают путем частичного расщепления высокомолекулярной хромосомной ДНК, предназначенной для клонирования. Полученными таким образом рекомбинантными ДНК трансформируют протопласты клеток дрожжей, и образовавшиеся трансформанты отбирают на селективной твердой питательной среде. В таком векторе удавалось осуществлять клонирование фрагментов ДНК длиной до 700 т.п.о.
При всех своих достоинствах системы клонирования, основанные на векторах семейства YAC, обладают рядом существенных недостатков. В рекомбинантных ДНК, поддерживаемых в таких системах, часто возникают внутренние делеции. Кроме того, при введении рекомбинантных ДНК в клетки дрожжей иногда имеет место проникновение в одну клетку нескольких молекул вектора со вставками. В итоге отдельные клоны дрожжевых клеток могут содержать несколько несцепленных друг с другом молекул рекомбинантных ДНК, а рекомбинация между ними вообще может приводить к образованию химерных молекул. Все это очень затрудняет физическое картирование генов в хромосомах исследуемых объектов.
Рис. 9. Схема клонирования сверхдлинных молекул ДНК с использованием вектора YAC
1 – линеаризация ДНК вектора рестриктазой BamHI;
2 – расщепление линеаризованной ДНК вектора рестриктазой EcoRI с образованием "плечей"; 3 – введение в вектор клонируемого EcoRI-фрагмента ДНК
Трансгенных мышей получали микроинъекцией в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки или трансфекцией ЕS-клеток с помощью YАС, несущих несколько родственных генов или один большой ген. Трансгенные мыши, несущие кластер из пяти функциональных генов β-глобина человека суммарной длиной примерно 250 т. п. н., экспрессировали все эти гены тканеспецифично и в нужное время — точно так же, как это происходит у человека. Такое соответствие обеспечивалось фланкирующими их последовательностями, которые содержат промотор и другие важные регуляторные элементы.
Создание мышей, которые синтезировали бы только человеческие антитела, — это примечательный пример трансгеноза с помощью YАС. Моноклональные антитела можно использовать для лечения некоторых заболеваний человека. Однако получить человеческие моноклональные антитела практически невозможно. К сожалению, и моноклональные антитела грызунов иммуногенны для человека. Чтобы «очеловечить» существующие моноклональные антитела грызунов, были разработаны сложные стратегии с использованием рекомбинантных ДНК. В результате этих трудоемких процедур удалось получить Fv- и Fab-фрагменты, зачастую обладающие каким-то сродством к специфическому антигену. Возможно, технологического прорыва удастся достичь, если использовать для получения полноразмерных человеческих антител более доступный метод с использованием гибридом.
Синтез природных антител — это настоящее чудо. Антитело — очень сложная тетрамерная конструкция, состоящая из двух пар разных цепей. Одна из них называется тяжелой (Н), а другая - легкой (λ или κ). Эти термины отражают различия в молекулярных массах субъединиц антитела. Генетические особенности каждой тяжелой цепи определяются комбинацией вариабельного (VH), дивергентного (DH), шарнирного (JH) и константного (СH) участков (доменов) соматической ДНК в В-клетке. Известны два типа легких цепей, λ и κ, которые образуются в результате перестройки их собственных вариабельных (Vλ, Vκ, шарнирных (Jλ, Jκ) и константных (Сλ, Сκ) доменов. Данная В-клетка синтезирует один вид антител, с уникальной комбинацией участков, составляющих Н-цепь, и либо перестроенной λ-, либо κ-цепью.
Набор генетических элементов, обеспечивающих образование множества разных Н-цепей антител человека, включает около 95 VH-доменов, 30 DH-доменов, 6 JH-доменов и 5 основных константных (Сα, Сγ, Сδ, Сε, Сμ) доменов. Локус κ-генов содержит примерно 76 Vκ-доменов, 5 Jκ-доменов и один константный (Сκ) участок. Размер Н-локусов и κ-генов — от 1 до1,5 т. п. н. Для создания трансгенных мышей, способных синтезировать множество различных человеческих антител, необходимо инактивировать мышиные гены Н- и L-цепей, а затем встроить в хромосомную ДНК мыши YАС, содержащую гены Н- и L-цепей каждого человеческого гена иммуноглобулина.
Чтобы решить эту задачу, мышиные гены Н- и κ-цепей были заменены («нокаутированы») небольшим участком кластера генов Н-цепи человека и кластера генов κ-цепи человека. Трансгенные мыши с таким набором генов антител человека синтезировали человеческие антитела к некоторым антигенам; кроме того, были созданы гибридомы, продуцирующие человеческие моноклональные антитела. Однако разнообразие человеческих антител, продуцируемых такими трансгенными мышами, было невелико вследствие ограниченности набора вариабельных сегментов Н- и κ-цепей. Чтобы решить эту проблему, создали YАС с большим числом генов вариабельных участков Н- и κ-цепей гемоглобина человека.
Объединив четыре разные YАС с генами Н-цепей гемоглобина человека, создали YАС длиной 1000 т. п. н., несущую 66 VH-доменов, около 30 DH-сегментов, 6 JH-доменов, Сμ, Сδ и Сγ. Аналогично, из трех YАС, несущих различные домены Vκ, создали YАС длиной 800 т. п. н. с 32 Vκ-доменами, 5 Jκ-доменами и Сκ. ЕS-клетки трансфицировали по отдельности YАС с генами Н- и κ-цепей методом слияния клеток, отобрали клетки, в которых произошла интеграция YАС, с помощью селективного маркера и проверили целостность каждой вставки методом ПЦР. Инъецировали клетки, несущие встроенные гены Н- либо κ-цепи, в бластоцисты и идентифицировали особь-основателя с помощью ПЦР. Трансгенных мышей со вставками генов Н- и κ-цепей скрещивали по отдельности с мышами с инактивированными локусами этих цепей. Затем потомство скрещивали между собой, чтобы получить мышей, лишенных функциональных мышиных генов Н- и κ-цепей, но несущих обе вставки генов Н- и κ-цепей гемоглобина человека.
Трансгенные мыши с увеличенным числом человеческих VH- и Vκ-доменов синтезировали человеческие антитела. Их иммунизировали тремя разными антигенами, и в каждом случае гибридомы секретировали человеческие моноклональные антитела, обладающие высоким сродством к антигену, которым животные были иммунизированы. Весьма вероятно, что с помощью такой трансгенной системы удастся получать человеческие моноклональные антитела для использования их в медицине.