Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток

Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбрио­нальными стволовыми клетками (ЕS). ЕS-клетки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипотентности. Например, в определенный сайт не­существенного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно ото­брать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных жи­вотных (рис. 4). Это позволяет избежать слу­чайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных си­стем.

Рекомбинантные гены вводят в такие клетки любым из вышеупомянутых способов, а кроме того, электропорацией или другими стандартными методами, применяемыми для доставки генов в культивируемые соматические клетки. При этом вместе с исследуемыми генами возможно введение селектируемых маркеров, которые позволяют проводить отбор клеток, экспрессирующих данные маркеры и, следовательно, гарантированно содержащих сцепленные с ними исследуемые гены. Отобранные таким образом клетки переносят в бластоцисты развивающихся эмбрионов или используют для получения агрегационных химер объединением их с клетками восьмиклеточных эмбрионов с последующей пересадкой эмбрионов псевдобеременным самкам.

При трансфекиии ЕS-клеток в культуре век­тором, предназначенным для интеграции в спе­цифический хромосомный сайт, в некоторых клетках ДНК встраивается случайным образом, в других встраивание происходит в нужный сайт, в большинстве же ЕS-клеток интеграции вообще не происходит. Для увеличения числа клеток первого типа используют так называе­мую позитивно-негативную селекцию. Эта стратегия состоит в позитивной селекции кле­ток, несущих векторную ДНК, встроившуюся в нужный сайт, и негативной селекции клеток с векторной ДНК, интегрировавшей в случайный сайт.

Сайт-мишень должен находиться в такой об­ласти геномной ДНК, которая не кодирует важ­ных белков, чтобы интеграция чужеродной ДНК не повлияла на процессы развития или клеточ­ные функции. Кроме того, существенно, чтобы встраивание трансгена не блокировало трансля­цию соответствующего участка генома. Поиск подобных сайтов ведется непрерывно.

Вектор для позитивно-негативной селекции обычно содержит следующие элементы: I) два блока последовательностей (НВ1 и НВ2), гомо­логичных отдельным участкам сайта-мишени; 2) трансген (ТG), кодирующий новую функцию реципиента; 3) последовательность, кодирую­щую устойчивость к соединению G-418 (Nео^r); 4) два разных гена тимидинкиназы (tk1 и tk2) ви­руса простого герпеса типов 1 и 2 (HVS-tk1 и HVS-tk2) (рис. 5, А). Ключевым для позитив­но-негативной селекции является взаимное рас­положение этих элементов. Трансген и ген ус­тойчивости к G-418 (Neо^r) должны находиться между двумя участками ДНК, гомологичными сайту-мишени, а гены HVS-tk1 и HVS-tk2 - по бокам этой конструкции. Если встраивание происходит в случайный сайт (не в НВ1 и НВ2), то с высокой вероятностью вместе с другими по­следовательностями интегрируют один или оба гена НVS-tk (рис. 5, А). Напротив, если инте­грация происходит в результате гомологичной рекомбинации путем двойного кроссинговера в нужный сайт, то в геном встроятся только трансген и ген Neо^r, а гены НVS-tk — нет (рис. 5, Б). При выращивании трансфицированных клеток в присутствии G-418 клетки, не не­сущие ген Neо^r, расти не будут. Выживут только клетки, в которых произошла интеграция - иными словами, осуществляется позитивная се­лекция. Если одновременно с G-418 в среду добавить ганцикловир, то рост клеток, синтези­рующих тимидинкиназу, будет подавлен, по­скольку этот фермент катализирует превраще­ние ганцикловира в токсичное соединение, летальное для клетки, т. е. произойдет негатив­ная селекция. Клетки, прошедшие через такое двойное сито, скорее всего будут содержать пос­ледовательность, встроившуюся в нужный сайт. Хоть этот метод не застрахован от ошибок, он позволяет обогатить клеточную популяцию клетками, несущими трансген в специфичном хромосомном сайте.

Электропорация

Этот метод основан на способности клеточной мембраны, становиться проницаемой для экзогенных молекул ДНК под действием импульсов высокого напряжения. Когда различия в потенциалах на внешней и внутренней поверхности мембраны превысят определенный уровень, формируются временные поры, через которые способны проходить экзогенные молекулы. Изменение количества пор в мембране обратимо при условии, что величина или продолжительность импульсов высокого напряжения не превысит критического предела. Размер пор зависит от длины импульсов, силы электрического поля, а также ионного состава среды.