Трансгенные птицы

Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яйце­клетки птиц с целью получения трансгенных линий — непростая процедура. Это связано с не­которыми особенностями воспроизводства и развития птиц. Так, при оплодотворении у птиц в яйцеклетку могут проникнуть сразу несколько сперматозоидов, а не один, как это обычно бы­вает у млекопитающих, и идентифицировать тот мужской пронуклеус, который соединится с женским, становится невозможно. Метод микроинъекции ДНК в цитоплазму тоже не подхо­дит, поскольку в этом случае ДНК не интегри­руется в геном оплодотворенной яйцеклетки. Наконец, даже если удастся осуществить микро­инъекцию ДНК в ядро, дальнейшие операции будет трудно осуществить, поскольку у птиц яй­цеклетка после оплодотворения достаточно бы­стро обволакивается прочной мембраной, по­крывается слоем альбумина и внутренней и наружной известковыми оболочками.

Однако трансген можно вводить в область желтка (зародышевый диск), который содержит и женский, и мужской пронуклеусы и образует­ся раньше, чем скорлупа. После введения ДНК каждую яйцеклетку культивируют in vitro, и ко­гда образуется зародыш, его помещают в сурро­гатное яйцо, чтобы имитировать вылупление. При помощи такой стратегии была получена од­на линия трансгенных цыплят. Однако в насто­ящее время этот метод неэффективен и техниче­ски трудновыполним в обычных условиях.

К тому времени, когда наружная известковая оболочка яйцеклетки птиц затвердевает, заро­дыш, находящийся на стадии бластодермы, со­стоит из двух слоев по 40 000 и 80 000 клеток. Проведены эксперименты по инокуляции такого зародыша ретровирусными векторами с нару­шенной репликацией, несущими бактериальные маркерные гены. В результате были получены трансгенные цыплята и обыкновенные перепела, несущие чужеродные гены в клетках зародыше­вой линии. Обычно такие птицы не продуцируют свободных вирусных частиц, и тем не менее при­менение ретровирусных векторов в качестве «по­ставщиков» чужеродных генов животным, кото­рые затем могут использоваться в пищу, неизбежно вызывает вопросы относительно без­опасности такого подхода. Кроме того, размер трансгена, который может быть введен в орга­низм реципиента в составе ретровирусного век­тора, не превышает ~8 т. п. н., а в некоторых слу­чаях интеграция в исходный сайт нестабильна. Все это заставило исследователей искать альтер­нативные способы трансгеноза.

Никаких специфичных для птиц ЕS-клеток не обнаружено, поэтому подход, основанный на их использовании, для птиц неприменим. Более перспективным представляется метод с исполь­зованием рекомбинантных эмбриональных кле­ток. Он состоит в следующем. Выделяют клетки бластодермы из куриного эмбриона, трансфицируют их с помощью катионных липидов (липо-сом), связанных с трансгенной ДНК (липосомная трансфекция), и повторно вводят в подзародышевую область свежеотложенных яиц (рис. 11). Часть потомков будет нести в каком-то неболь­шом количестве клетки донора: таких животных называют химерами. У некоторых химер клетки, произошедшие от трансфицированных клеток, могут образовывать линии зародышевых клеток, и после нескольких раундов скрещиваний таких химер можно получить линии трансгенных жи­вотных. Чтобы увеличить вероятность создания химер, несущих чужеродные гены в клетках за­родышевой линии, число донорских клеток в химерах можно увеличить облучением эмбрио­нов реципиента перед введением в них трансфи­цированных клеток (540-660 рад в течение 1 ч). Под действием облучения некоторые (но не все) клетки бластодермы погибнут, и соотношение между трансфицированными клетками и клет­ками реципиента увеличится в пользу первых. По-видимому, таким образом можно получать трансгенных цыплят, хотя и с малой эффектив­ностью.

Трансгенных цыплят можно использовать для улучшения генотипа уже существующих по­род — для придания им (in vivo) устойчивости к вирусным инфекциям и заболеваниям, вызыва­емым кокцидиями, повышения эффективности усвоения пищи, снижения уровня жира и холестерола в яйцах, повышения качества мяса. Бы­ло предложено также использовать яйцо с его высоким содержанием белка в качестве источ­ника белковых продуктов, использующихся в фармацевтической промышленности. Экспрес­сия трансгена в клетках репродуктивного пути курицы, где обычно секретируется большое ко­личество овальбумина, может способствовать накоплению соответствующего белкового про­дукта в яйце, откуда его можно затем выделить.

Рис. 11. Получение трансген­ных цыплят трансфекцией изоли­рованных клеток бластодермы. Выделенные клетки трансфицируют трансгеном с помощью липосом и вводят в подзародышевую область облученной бластодермы реципиента. Часть полученных потомков являются химерами, а некоторые из них, несущие трансген в клетках зародышевой линии, при скрещивании могут дать нача­ло трансгенным линиям.