Раздел 9.6. Генотерапия ненаследственных заболеваний:

опухоли, инфекции.

Параллельно с развитием исследований в области генокор-

рекции наследственных дефектов успешными также оказались по-

иски методов терапевтического использования смысловых после-

довательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний

и, главвным образом, злокачественных опухолей и вирусных ин-

фекций. Существенно, что именно в этих разделах патологии

поиски путей генокоррекции проводятся особенно интенсивно, а

число уже одобренных протоколов клинических испытаний во

много раз превышает число таковых для лечения моногенных бо-

лезней (см.Рис. 9.1). Такое положение дел, по-видимому,

прежде всего объясняется широкой распространенностью онколо-

гических заболеваний и отсутствием достаточно эффективной

терапии. В Табл. 9.3 перечислены основные методологические

подходы к генотерапии различных опухолей, разработанные и

широко используемые уже на современном этапе. Многие из этих

подходов вполне приложимы и для борьбы с наиболее серьезными

инфекционными заболеваниями, например, со спидом.

Таблица 9.3. Основные методологические подходы в генокоррек-

ции онкологических заболеваний.

---------------------------------T-----------------------------¬

¦ П Р И Н Ц И П ¦ ВВОДИМЫЕ ГЕНЫ ¦

+--------------------------------+-----------------------------+

¦1. Повышение иммунореактивности ¦ гены чужеродных ¦

¦ опухоли ¦ антигенов, цитокинов ¦

¦2. Генетическая модификация ¦ гены цитокинов, ¦

¦ иммунных клеток ¦ ко-стимуляторов ¦

¦3. Инсерция генов "чувствитель- ¦ гены тимидин-киназы HSV, ¦

¦ ности" либо генов "самоубийц"¦ цитозин дезаминазы ¦

¦4. Блок экспрессии онкогенов ¦ антисмысловые Ki-ras мРНК, ¦

¦ ¦ гены внутриклеточных антител¦

¦5. Инсерция генов-супрессоров ¦ р53 ¦

¦ опухолей ¦ ¦

¦6. Защита нормальных клеток от ¦ гены лекарственной ¦

¦ химеотерапии. ¦ устойчивости тип 1. ¦

¦7. Индукция синтеза противоопухо¦ гены интерлейкина-2, ¦

¦ левых в-в нормальными клеткам¦ интерферона ¦

¦8. Продукция противопухолевых ¦ вакцины типа БЦЖ, экспресси-¦

¦ рекомбинантных вакцин. ¦ рующей опухолевой антиген ¦

¦9. Локальная радиопротекция нор-¦ гены трансферазы, ¦

¦ мальных тканей с помощью ¦ глутатион синтетазы ¦

¦ антиоксидантов. ¦ ¦

L--------------------------------+------------------------------

Подробный анализ используемых при этом подходов и ре-

зультаты первых клинических испытаний выходит за рамки наше-

го изложения. Однако, материал этот настолько интересный и

многообещающий, что мы позволим себе на нескольких примерах

охарактеризовать основные принципы построения таких геноте-

рапевтических программ.

Как упоминалось ранее (см. 9.1), перенос гена в орга-

низм человека был осуществлен в 1989 году в большей степени

в исследовательских, а не в терапевтических целях. Это был

маркерный прокариотический ген neo, сообщающий клеткам ус-

тойчивость к неомицину. Он был введен пациенту, страдающему

злокачественной меланомой, в составе трансдуцированных

TIL-клеток (Т -лимфоцитов, полученных из опухолевых тканей

больного). В 1986г. вскоре после идентификации этого нового

класса иммунных клеток, была предпринята попытка лечения ме-

ланомы путем аутологичной внутривенной инфузии TIL-клеток,

предварительно выделенных из опухолей пациентов и интенсивно

наращиваемых in vitro в присутствии ростового фактора IL-2.

Примерно у трети пациентов лечение оказалось эффективным,

хотя в последующем наблюдали значительное число рецидивов

заболевания. Для анализа причин терапевтического эффекта TIL

-клеток и совершенствования методики лечения меланомы необ-

ходимо было исследовать устойчивость вводимых T-лимфоцитов и

их миграцию в организме больного. С этой целью была произве-

дена маркировка используемых для лечения TIL-клеток путем их

трансдукции в культуре ретровирусным вектором, несущим ген

neo, с последующим отбором неомицин-устойчивых клонов и вы-

ращиванием их на среде G418. Результаты исследований показа-

ли, что реинфузированные G418-устойчивые TIL-клетки действи-

тельно проникают в опухоль и могут быть обнаружены там в не-

большом количестве даже спустя 9 недель после введения. Най-

дены отличия субпопуляции T-лимфоцитов в опухоли от общей

популяции инфузированных TIL-клеток.

После успешного испытания переноса маркерного гена neo

в опухолевые ткани путем аутологичной реинфузии трансфециро-

ванных T-лимфоцитов лечение меланомы было дополнена введени-

ем в вектор мышиного гена, контролирующего продукцию, так

называемого фактора некроза опухоли - TNF. Предолагалось,

что локальная секреция этого токсичного для клеток белка в

опухолевых тканях будет способствовать формированию иммунно-

го ответа. Опасность данной терапевтической процедуры обус-

ловлена возможностью разрушения TIL-клеток в печени, мозге и

легких. Поэтому экспрессия TNF-гена под гетерологичным про-

мотором может оказать сильный токсический эффект в этих ор-

ганах. Первые клинические испытания описанной схемы лечения

начаты в январе 1991 года в Национальном Институте Здоровья

(NIH) США.

Другая программа генной терапии, предложенная для лече-

ния меланом, основана на стимуляции противоопухолевого имму-

нитета, опосредованного T-лимфоцитами. Для этого в изолиро-

ванные опухолевые клетки пациента вводят TNF- или IL2-ген

или какие-либо другие гены, секретирующие цитокины, и затем

проводят иммунизацию пациента путем подкожного введения

трансдуцированных клеток. Эта процедура сама по себе может

привести к рассасыванию первичной опухоли или может быть ис-

пользована для изоляции более эффективных TIL-клеток из лим-

фоузлов, вблизи от места инъекции. Подобная иммунизация мо-

жет быть рекомендована для предотвращения рецедивов у паци-

ентов, подвергавшихся другим курсам противоопухолевой тера-

пии. Первая попытка прямого переноса гена в опухолевые клет-

ки пациента без их предварительной изоляции также была

предпринята с целью формирования иммунного ответа против

злокачественной меланомы. Процедура включала прямую иньекцию

в опухоль липосом-плазмидного комплекса с геном, контролиру-

ющим отсутствующий у пациента антиген гистосовместимости

HLA-B7. Другой тип модификации опухолевых клеток основан на

введении в них гена тимидинкиназы Герпеса. Использованный в

работе ретровирусный вектор обеспечивал включение генной

конструкции только в активно пролифирирующие клетки, каковы-

ми и являются клетки опухоли. Впервые эта схема была апроби-

рована при лечении карциномы яичника. После интраперитоне-

альной аутологичной иньекции трансдуцированных клеток злока-

чественной карциномы пациентам назначали противогерпесный

препарат - ганцикловир, избирательно убивающий клетки, экс-

прессирующие ген вирусной тимидин-киназы. Противоопухолевый

эффект был обусловлен летальным действием токсина, образую-

щегося в модифицированных клетках и последующей иммунной ре-

акцией организма на опухолевые клетки.

Подходы, используемые для лечения вирусных инфекций пу-

тем введения в организм человека специфических нуклеиновых

кислот, очень разнообразны и основаны на детальном исследо-

вании молекулярных механизмов взаимодействия инфецирующих

агентов с клетками-хозяина. Мы лишь коротко перечислим ос-

новные принципы, используемые при разработке соответствующих

медицинских протоколов. Наибольшее количество противовирус-

ных программ генной терапии предложено в рамках борьбы со

спидом, хотя аналогичные методы разрабатываются для лечения

гепатита, цитомегаловирусных, герпесных и иных вирусных ин-

фекций. Одна из первых таких программ была направлена на

разрушение регуляторных механизмов репликации вируса иммуно-

дефицита - HIV, путем введения в T-лимфоциты от 20 до 50 ко-

пий TAR-гена, кодирующего активирующий элемент, критический

для переключения генетической программы клетки на вирусную

репликацию. Другая программа включала введение в T-лимфоциты

гена CD4 вирусного антигена для специфического связывания

HIV и выведения его в русло крови. Ряд программ основаны на

введении в T-клетки условно летальных генов, таких как ген

вирусной тимидинкиназы, с тем, чтобы предотвратить нежела-

тельные побочные эффекты в случае неконтролируемого размно-

жения этих клеток или слишком сильного их действия на

HIV-инфецированные клетки. Одним из направлений повышения

эффективности терапевтического использования T-лимфоцитов

для лечения спида является направленная модификация ex vivo

генов главного комплекса гистосовместимости и конструирова-

ние на этой основе "универсальных донорских" клеток. Так,

лишенные HLA-маркеров гетерологичные модифицированные

T-клетки могут быть трансплантированы пациентам без опасения

иммунологической несовместимости. Подобный подход может ока-

заться эффективным при необходимости гетерологичной транс-

плантации в терапевтических целях любых типов клеток. Прин-

ципиально иным способом борьбы с вирусными инфекциями явля-

ется введение в пораженные ткани антисмысловых последова-

тельностей, способных гибридизоваться с вирусами и, таким

образом, их нейтрализовывать (Cohen, Hogan, 1994; Wagner,

1994). Адресность доставки таких последовательностей может

быть достигнута путем их комплексирования с соответствующими

белковыми лигандами (см. 9.4.2).