Глава IX.

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ.

Раздел 9.1 Определение, историческая справка, програм-

мы генной терапии.

В широком смысле слова генная терапия означает лечение

путем введения в ткани или в клетки пациента смысловых пос-

ледовательностей ДНК. Первоначально генная терапия рассмат-

ривалась как возможность исправления дефекта в гене. Счита-

лось, что основным обьектом для такого лечения будут служить

моногенные наследственные заболевания человека, причем тео-

ретически представлялась вероятной коррекция генного дефекта

как на соматическом уровне, так и на уровне зародышевых (по-

ловых) клеток. Многочисленные эксперименты по созданию

трансгенных животных, начатые после 1980 г., а также на

культурах клеток внесли существенные коррективы в эти теоре-

тические представления. Во-первых, оказалось значительно

проще исправлять не сам дефект в гене, то есть заменять весь

мутантный ген или его мутированный фрагмент на нормальный, а

вести коррекцию путем введения в организм пациента полноцен-

но работающего гена (обычно его кДНК). Во-вторых, несмотря

на решающие успехи генной инженерии последних лет, исследо-

вания по геннной терапии у человека осуществляются исключи-

тельно на соматических тканях, в которых в норме происходит

экспрессия дефектного гена. Генная терапия на уровне половых

и зародышевых клеток человека ввиду возможных серьезных пос-

ледствий для генофонда человечества представляются весьма

проблематичной и на данном этапе наших знаний - малореаль-

ной. И наконец, в-третьих, уже разработанная и применяемая

на практике методология генной терапии оказалась пригодной

для лечения не только моногенных наследственных заболеваний,

но и таких широко распространенных болезней, какими являются

злокачественные опухоли, многие виды тяжелых вирусных инфек-

ций, включая спид, сердечно-сосудистые и другие заболевания.

Учитывая эти обстоятельства, генную терапию на современном

этапе можно определить как лечение наследственных, онкологи-

ческих, некоторых инфекционных (вирусных) и других заболева-

ний путем введения генов в клетки пациентов с целью направ-

ленного изменения генных дефектов, либо придания клеткам но-

вых функций (Culver, 1994). Первые клинические испытания ме-

тодов генной терапии были предприняты 22 мая 1989г. с целью

генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов

в случае прогрессирующей меланомы. Маркированные прокариоти-

ческим геном neo, Т-лимфоциты были устойчивы к неомицину и

могли быть легко отселектированы в культуре, что позволило

детально проследить их судьбу в кровотоке и избирательное

накопление в опухолях (подробней см. 9.5).

Первым моногенным наследственным заболеванием, в отно-

шении которого были применены методы генной терапии, оказал-

ся наследственный иммуннодефицит, обусловленный мутацией в

гене аденозин-дезаминазы. 14 сентября 1990г.в Бетезде (США)

4-х летней девочке, страдающей этим достаточно редким забо-

леванием (1 : 100 000), были пересажены ее собственные лим-

фоциты, предварительно трансформированные ex vivo геном ADA

(ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект

наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процеду-

ра была повторена с интервалом 3-5 месяцев (Anderson, 1992;

Culver, 1994). В течение 3-х лет терапии в общей сложности

проведено 23 внутривенных трансфузии ADA-трансформированных

Т-лифоцитов без видимых неблагоприятных эффектов. В резуль-

тате лечения состояние пациентки (Ашанти В. ДеСильва) нас-

только улучшилось, что она смогла вести нормальный образ

жизни и не бояться случайных инфекций. Столь же успешным

оказалось и лечение второй пациентки с этим заболеванием

(подробней см. раздел 9.5). В настоящее время клинические

испытания генной терапии этого заболевания проводятся в Ита-

лии, Франции, Великобритании и Японии.

Другие моногенные наследственные заболевания, в отноше-

нии которых уже имеются официально разрешенные протоколы и

начаты клинические испытания, касаются семейной гиперхолес-

теринемии (1992); муковисцидоза (1993); гемофилии В (1992);

болезни Гоше (1993). В отношении многих других заболеваний

медицинские протоколы клинических испытаний находятся в ста-

дии утверждения (см. раздел 9.5.). К 1993г. только в США к

клиническим испытаниям генно-инженерных конструкций на чело-

веке было допущено 53 проекта (Culver, 1994). К 1995г. в ми-

ре число таких проектов возросло до 100 и более 400 пациен-

тов было непосредственно вовлечено в эти исследования (Hodg-

son, 1995). Подавляющее большинство таких проектов (86) ка-

салось лечения онкологических заболеваний, а также спида.

Таким образом, от опытов на животных и теоретических

построений 80-х годов уже в 1990 году удалось приступить к

реальному лечению моногенных заболеваний, число которых

стремительно нарастает. Естественно, что подобные революци-

онные перемены могли возникнуть только в результате решающих

успехов молекулярной биологии в картировании генов, мутации

которых приводят к наследственным заболеваниям (см.Главу

III), выяснении молекулярной природы этих мутаций (см.Главу

IV), успехов в секвенировании и клонировании генов (см.Главы

I и II), создании генно-инженерных конструкций (см.Главу

II), отработки и совершенствования методов их доставки

(см.ниже). Следует также подчеркнуть, что качественный ска-

чок в области генной терапии, когда сам ген стал рассматри-

ваться как лекарственный препарат, стал возможен благодаря

тому, что предшествующие экспериментальные и клинические

исследования доказали безопасность генной терапии.

Вместе с тем, и в сегодняшних исследованиях по генной

терапии необходимо учитывать, что последствия манипулирова-

ния генами или рекомбинантными ДНК in vivo изучены недоста-

точно. Следует помнить, что введение в организм человека

последовательностей ДНК, не находящихся под контролем свойс-

твенных им регуляторных элементов, может приводить к трудно

предсказуемым измененим метаболических процессов и сопровож-

даться функциональным дисбалансом. Современные представления

о структуре генома и его взаимодействиях с экзогенными ДНК и

вирусными последовательностями, часто используемыми в ка-

честве векторов для переноса генов (см. 9.2), могут оказать-

ся недостаточными для прогнозирования возможных нежелатель-

ных или неконтролируемых последствий такого вмешательства.

Поэтому при разработке программ генной терапии принципиаль-

ное значение имеют вопросы безопасности предлагаемых схем

лечения как для самого пациента, так и для популяции в целом

(Anderson, 1992; Miller, 1992). Важно, чтобы при проведении

испытаний ожидаемый лечебный эффект или возможность получе-

ния дополнительной полезной информации превосходили потенци-

альный риск предлагаемой процедуры. Неслучайно, в странах с

наиболее продвинутым уровнем исследований в этой области,

особенно в США, медицинские протоколы с использованием смыс-

ловых последовательностей ДНК подвергаются обязательной экс-

пертизе в соответствующих комитетах и комиссиях. Клинические

испытания предложенной генотерапевтической процедуры возмож-

ны только после ее одобрения соответствующим законодательно

утвержденным органом. В США таковыми являются: Консультатив-

ный Комитет по Рекомбинантным ДНК (Recombinant DNA Advisory

Committee - RAC), Комитет по лекарствам и пищевым продуктам

(Food and Drug Administration -FDA), с последующим обяза-

тельным утверждением проекта директором Национального Инсти-

тута Здоровья (National Institute of Health) (Miller, 1992;

Anderson, 1992; Culver, 1994). В Европе такие протоколы сос-

тавляются и утверждаются в соответствии с рекомендациями Ев-

ропейской Рабочей Группы по Переносу Генов и Генной Терапии

(European Working Group on Human Gene Transfer and Therapy)

(Cohen-Haguenauer, 1995). Программы генной терапии для кли-

нических испытаний должны включать следующие разделы: обос-

нование выбора нозологии для проведения курса генной тера-

пии; определение типа клеток, подлежащих генетической моди-

фикации; схему конструирования экзогенной ДНК; обоснование

биологической безопасности вводимой генной конструкции,

включающая опыты на культурах клеток и на модельных (транс-

генных) животных; разработку процедуры ее переноса в клетки

пациента; методы анализа экспрессии введенных генов; оценку

клинического (терапевтического) эффекта; возможные побочные

последствия и способы их предупреждения (Culver, 1993; Co-

hen-Haguenauer, 1995).

Важнейшим элементом в программе генной терапии является

анализ последствий проводимых процедур. Этот контроль прово-

дят на всех этапах терапии, причем исследования выполняют на

различных уровнях. Прежде всего, после переноса гена осу-

ществляют поиск модифицированных клеток в организме пациента

и следят за динамикой этих клеток в определенных тканях.

Этот поиск может быть облегчен при наличии маркерного гена в

конструкции. Присутствие последовательностей экзогенной ДНК

в модифицированных клетках чаще всего идентифицируют с по-

мощью ПЦР. На следующем этапе производят анализ экспрессии

введенных генов путем идентификации и количественной оценки

соответствующего РНК-транскрипта, либо белкового продукта

гена. В тех случаях, когда это возможно, проводят анализ

коррекции первичного биохимического дефекта. Затем, все по-

лученные данные сопоставляют с результатами комплексного ме-

дицинского обследования и вносят необходимые исправления и

добавления в проводимую схему лечения.