Методы выделения и очистки антибиотика
Выделение и очистку антибиотика осуществляют разными способами в зависимости от химической природы антибиотика, от сопутствующих антибиотику компонентов, от его локализации (внутри клетки или экстрагируется в культуральную жидкость).
Первый этап – концентрирование антибиотика и очистка его от сопутствующих балластных веществ. Основными методами выделения антибиотика из культуральной жидкости являются осаждение антибиотика (чаще всего органическими растворителями) или его экстракция, если он находится внутри клетки (также органические растворители). Также используют сорбцию антибиотика с использованием ПАВ (например, активированный уголь, активированная окись алюминия, ионообменные смолы с последующей десорбцией). Антибиотик, полученный после первого этапа – технический препарат, не может использоваться в клинике.
Второй этап – дальнейшая очистка препарата путем повторной сорбции, или перекристаллизации, или растворением антибиотика в органических растворителях.
Полученный таким способом антибиотик тестируют на расширенный антимикробный спектр и на токсичность. Расширенный антимикробный спектр – это совокупность микроорганизмов, относящихся к разным таксономическим группам (бактерии, вирусы, грибы). Определяют механизм действия – бактерицидное или бактериостатическое (для каждой группы).
Следующий шаг – исследование антибиотика на стерильность, на содержание антибиотикорезистентных штаммов. Для этого антибиотики растворяют в воде или других растворителях. Антибиотик желательно инактивировать. Проводят высев на агар.
Проводится проверка токсичности на лабораторных животных – мышь, морские свинки и кролики. Им в течение определенного времени внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно или подкожно вводят различные дозы антибиотиков, и наблюдают за животными в течение определенного времени. Более глубокое изучение предусматривает влияние антибиотика на формулу крови, на отдельные ткани и органы, кроме того используют активность препарата в биологических жидкостях – в крови и гнойной жидкости, определяют время циркуляции антибиотика в организме и сроки его выведения.
Определяют также лечебные свойства антибиотика – фармакологические и терапевтические свойства. Лечебные свойства проверяют на экспериментальных животных и на волонтерах. Животных заражают определенной дозой патогенных микроорганизмов, обычно используют летальную дозу (LD50), которая вызывает смертность 50% подопытных животных без лечения, и LD100. Животных делят на три группы. В первую группу антибиотик вводят одновременно с заражением, для второй – через какое-то время после заражения, третья группа – контрольная, антибиотик не вводят. При этом при первоначальной оценке вводят максимально переносимую дозу антибиотика. О терапевтической дозе судят по количеству выживших животных. Затем то же самое делают с разными концентрациями антибиотиков (понижают), и определяют минимальную терапевтическую дозу, которая предохраняет от гибели животных.
Определение
терапевтического индекса. Терапевтический
индекс определяют по отношению минимальной
токсической дозы к дозе антибиотика,
которая вызывает различные токсические
эффекты:
,
и чем меньше терапевтический индекс,
тем лучше показатели антибиотика (разрыв
между терапевтической дозой и токсической
очень большой, то есть чем больше
токсическая доза и меньше терапевтическая
доза, тем лучше для антибиотика). Самый
маленький терапевтический индекс у
пенициллина.