Технология получения аб

Выделение штамма-продуцента АБ из природных условий

↓

Селекция наиболее активного штамма

↓

Получение наиболее активного штамма путем

│

^{_________________________________________________________________________}

↓ ↓ ↓

Индуцированного мутагенеза Слияния протопластов Генно-инженерных манипуляций

│ │ │

^{__________________________________________________________________________}

↓

Высокопродуктивный и экономически-выгодный штамм продуцента

↓

Продуцент

↓

ПМ←ПС

↓

Подготовка иннокулята

↓

Смешанная культура→Культивирование←Монокультура

↓

Разделение

^{_________________________________________________________________________}

↓ ↓

КЖ б/м

│ │

^{__________________________________________________________________________}

↓

Выднление АБ

↓

Очистка

↓

Концентрирование

↓

Стабилизация

│

^{_________________________________________________________________________}

↓ ↓

Обезвоживание Стандартизация

↓ ↓

Измельчение Жидкий препарат

↓ │

Сухой препарат │

↓ ↓

^{__________________________________________________________________________}

↓

Фасовка

↓

Хранение

Стадия биосинтеза включает: подготовку ПМ; производственное культивирование. Это основная биологическая стадия получения АБ. Главная задача этой стадии – создание оптимальных условий для развития продуцента. Результативность стадии зависит от стоимости ПС, стоимости предшественников, от уровня активности продуцента и времени накопления АБ в питательной среде, от общих энергетических затрат ит.д.

Стадия включает методы культивирования, стерилизации, подготовку ПМ. Для максимального выхода АБ разрабатывают комплекс мер включающих подбор ПС и режимов культивирования организма, который отвечает условиям управляемого биосинтеза.

Подготовка ПМ проходит в несколько стадий:

1. М.о. из лиофильно высушеного состояния пересевается на пробирку с агаризованной средой для подращивания на косячках.

2. С косячка – высев в колбу с жидкой ПС и подращивание на качалке. Культура должна достичь физиологической активности – середина логарифмической фазы роста.

3. Из колбы в колбу (регенерация культуры).

4. Высев в ферментер предварительного иннокулирования

5. В ферментер иннокулирования

6. Обьем 10-15% в основной ферментер

Производственное культивирование осуществляется в ферментерах:

• лабораторных, выполненных из нержавеющей стали или стекла, не более 30 л емкости, стерилизуют их в автоклаве и заполняют стерильной средой;

• полупроизводственные емкости (100 л);

• производственные ферментеры (500 л – 100 м³).

Стерилизация двух последних – прогретым паром.

Выращивание продуцентов ведут только глубинным способом культивирования. 4 модификации:

1. Периодическое культивирование в закрытой системе. При этом продуцент проходит все стадии роста. Процесс заканчивается синтезом АБ, после чего ферментер освобождается от КЖ, промывается, стерилизуется и вновь подготавливается

2. Отьемно-доливной способ. Периодический отбор от30% до 60% обьема общей КЖ и одновременно этот оббьем новой среды вносится в ферментер.

3. Батарейный способ. М.о. развивается в ряду последовательно соединенных ферментеров. КЖ на определенной стадии развития перекачивается из одного ферментера в другой, а освобожденный ферментер загружается свежей ПС. Этот способ рационален.

4. Метод непрерывного культивирования. В основе – метод непрерывного протока ПС. Скорость потока определяется таким образом, чтоб поддерживать культуру на определенной стадии развития.

Периодический способ обеспечивает больший выход, но в промышленности используют непрерывный – более технологичный. Но в промышленных условия непрерывный способ ведут в 2 стадии: 1) в первом аппарате батареи поддерживают высокую скорость роста; 2) во втором аппарате поддерживают низкую скорость роста, здесь происходит биосинтез АБ.

В процессе культивирования уделяется большое внимание пеногашению, которое определяется тем, что в ПС содержатся белковые вещества, и высокой вязкостью самой среды. Пеногасители: кашалотовый жир, растительные масла (соевое, подсолнечное), минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты и высшие жирные кислоты, синтетические вещества.

Когда внесение пеногасителя снижает выход продукта, используют механическое пеногашение: отсасывание пены; разрушение пузырьков пены и т.д.

Выделение и очистка. Выделение АБ по окончанию культивирования определяется его местом локализации. У большинства продуцентов АБ выделяется в КЖ, у другой части – выделяется и какое-то количество сосредотачивается внутри клетки, у небольшого числа – полностью внутри клетки.

В зависимости от продуцента:

- фильтрация;

- центрифугирование;

- сепарирование.

При центрифугировании важно выбрать режим, который позволит полностью отделить б/м от КЖ. Используют до 15 тис. об/мин.

При сепарировании – 7-7,5 тис. об/мин.

Для грибов микромицетов используют фильтр-пресс, нутч-фильтр, друк-фильтр. Фильтр-пресс используют для больших обьемов производства (фильтрование давлением). Два других фильтра – для небольших обьемов. Нутч-фильтр работает под вакуумом, друк-фильтр – под давлением над фильтрующей жидкостью.

После отделения КЖ и клеток, АБ извлекается из места локализации и очищается. Если АБ находится в КЖ его извлекают методом экстракции (используют органические растворители, которые не смешиваются с водной фазой) или используют сорбцию, применяя ионно-обменные смолы. Если АБ находится в клетках, то его экстрагируют органическими растворителями.

Концентрированное антибиотическое вещество подвергают очистке. Цель очистки – сконцентрировать и очистить от балластных и неактивных компонентов.

Методы очистки:

1. Перекристаллизация – это многократный переход АБ из растворителя в растворитель с предварительным осаждением

2. Ионообменная сорбция

3. Осаждение – АБ связывают с органическими или неорганическими веществами для получения соединения, которое выпадает в осадок. Осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием, отмывают и высушивают.

Сушка. Контроль и расфасофка препарата.

Большинство АБ термолабильны. Поэтому:

• наиболее часто используется лиофильная сушка (из замороженного состояния до 20 ^оС)

• распылительная сушка (в процессе прогретого воздуха несколько секунд)

• вакуумная сушка (для пастообразных или зернистых препаратов АБ)

Контроль препарата: биологический, фармакологический. Биологический контроль на стерильность. Фармакологический контроль – проверка на токсичность, пирогенность, активность.

Расфасовка и упаковка. Упаковка препарата должна содержать: дату производства, срок хранения, биологическую активность препарата (мкг/мл, мкг/г или ед/мл, ед/г).