Лабораторный регламент

Венцом лабораторных исследований является лабораторный регламент.

Лабораторный регламент – это технологический документ, которым завершаются исследования в лабораторных условиях по разработке метода получения антибиотика.

Он служит основой для разработки промышленного регламента.

Основная его задача – разработка оптимального метода производства антибиотического вещества.

Лабораторный регламент включает:

1. Характеристика АБ

   • название антибиотика

   • основное назначение

   • краткое описание свойств препарата

   • описание организма, который вырабатывает АБ

   • методы определения биологической активности

   • условия хранения

2. Прилагается технологическая схема

3. Указывается сырье и материал: требования к качеству сырья и материалов (ориентировка на отечественное сырье)

4. Аппаратурная схема производства

5. Изложение технологического процесса (описывается процесс получения АБ на основе завершенных научных и экспериментальных результатов, которые получены в лабораторных условиях). ТС описывается по этапам. Описывается обьем, концентрация, среда, рН, степень аэрации, условия перемешивания, пеногасители, температура, продолжительность процесса и т.д.

6. Отходы производства, технологические и вентиляционные выбросы в атмосферу, их использование и обезвреживание

• перечень возможных отходов и выбросов

• наличие в отходах ценных веществ и рекомендации к их использованию

• наличие вредных веществ с точки зрения загрязнения окружающей среды и способы их обезвреживания

7. Контроль производства

Указывают особые требования к оборудованию (герметичность ферментера и комплектаций и т.д.); режимы стерилизации сред, отдельных веществ и воздуха; методы анализа процесса биосинтеза АБ и готовой продукции

8. Техника безопасности, пожарная безопасность и производственная санитария: перечень веществ способных воспламеняться и взрываться. Все вещества, которые используются в процессе биосинтеза АБ, должны быть изучены с точки зрения безопасности.

9. Перечень производственных инструкций, которые должны быть разработаны на основе лабораторного регламента

10. Технико-экономические нормативы

• выход продукта и промежуточных продуктов

• удельные нормы расхода сырья и материалов

• удельные нормы энергозатрат (пара, воды, ЕЕ, сжатого воздуха)

11. Информационный материал

• биологические и физико-химические свойства вещества

• степень очистки

• фармакологические свойства

• сравнение с показателями идентичных зарубежных препаратов

• сведенья о патентной чистоте препарата с перечнем охраняющихся авторских свидетельств

• вредность веществ и меры предосторожности работы с веществами

Повышение антибиотикообразования микроорганизмов продуцентов:

Для этого используют 3 этапа:

- селекция найболее активных форм подцуентов антибиотиков

- подбор ПС и подбор условий культивирования которые обеспецивают увеличение выхода антибиотика продуцентом

- порведение направленнгого биосинтез антибиотиков

І. Методы селекции (первичный отбор)

В основе лежат законы генетики.

Задача: с большого количества колоний в пределах одного штамма и проводят отбор наиболее высокопродуктивных колоний.

Метод напыления тест-культуры – на поверхность агаровой пластинки в чашке Петри производят рассев газона штамма-продуцента антибиотика, подбирая концентрацию исходной взвеси таким образом, чтобы выросло 40-50 изолированных колоний. После того, как колонии хорошо вырастут в термостате, на них напыляют взвесь тест-культуры определенной концентрации и ставят в термостат и по зонам задержки роста определяют продуктивность колоний. Если «-» - придется отделять клетки тест-культуры от клеток продуцента.

Существует модифицированный метод, который предусматривает наложение стерильной фильтровальной бумаги между питательной средой с микроорганизмом и на фильтровальную бумагу наливается питательная среда с тест-культурой. Сверху на питательной среде будут зоны задержки роста.

По окончании культивирования отмечают колонии, которые дают максимальную зону задержки роста; аккуратно снимают фильтровальную бумагу с питательной средой, а колонии пересевают на косячок для получения чистой культуры.

Метод, который предусматривает лунки. В агаре на питательной среде делаются лунки специальным луночным сверлом, и в эти лунки вставляются столбики агара с выращенными изолированными колониями продуцента (на 1-2 суток ставят в термостат). При этом питательная среда засеяна тест-культурой.

Эти методы позволяют получить высокопродуктивные штаммы.

Высокопродуктивные штаммы получают методом мутагенеза. Используют следующие мутагены:

- физические (УФ-лучи)

- химические (нитрозогуанидин, этиленамин и др.)

- биологические (гены-мутаторы).

Основная задача – подобрать дозу мутагена, который обусловит массовую гибель продуцента. Но на фоне этого будут выживать штаммы с повышенной продуктивностью. Можно повысить в 50-100 раз.

В селекции для грибов используются анастамозные культуры, которые получают в результате соединения двух конидий через цитоплазматические мостики (анастамозы), в последующем эти анастамозы давали высокую продукцию пенициллина, в результате таких манипуляций показал 5000 единиц активности по сравнению с 10-30 в исходном штамме.

В получении высокопродуктивных штаммов широко используется метод слияния протопластов:

- разрушение клеточной стенки (используются литические ферменты микроорганизмов)

- подбор стабилизатора, который не позволил бы протопластам лопнуть

- проведение слияния двух протопластов и получение полинуклеоидной клетки.

- создание условий, при которых будет регенерироваться клеточная стенка (для того, чтобы клетка могла делиться)

Недостаток: через определенной промежуток времени этот полинуклеоид становится нежизнеспособен.

Большое число рекомбинанта можно получить с помощью трансформации плазмидной ДНК в протопласты. Для того, чтобы протопласты смогли функционировать, его необходимо заключить в рибосомальную оболочку.

ІІ. Подбор условий культивирования продуцетов антибиотиков

1. Оптимизация ПС для накопления антибиотика

2. Отработка технологическеих режимов (рН, аерация, температура)

1. Классификация сред:

Среды жидкие – используются для промышленного культивирования

Среды плотные – используются для изучения цикла развития микроорганизмов, архитектоники колоний, для выделения чистой культуры

Сыпучие – для сохранения спор грибов и актиномицетов.

При выборе среды нужно учитывать физиологические особенности продуцента.

Например:Молочно-кислые бактерии требовательны к ростовым факторам

Основные компоненты ПС: N, C, микроэлементы, микроеэелементы, P, K, Ca, Mg, S, Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Co, галогены: Cl, I, Br

Источники N:

Аммонийные соли соли, HNO_3, гидролизаты белков

Использование аммонийных солей плесневыми грибами зависит от присутствия орг кислот, небольшое количество способствует лутшему усвоению азота – литарная, фумарная

Источник С:

Микроорганизмы очень чувствительны к нему. Установлено, что для некоторых микроорганизмов источником С есть: глюкоза и аспарагиновая кислота или глюкоза и молочная кислота.

При раздельном использовании этих источников антибиотическая активность штамма падает.

Основные источники С: картофельный крахмал, кукурузная мука – данные источники подходят для штаммов, которые обладают мощными амилолитическими ферментами.

Главное условие правильного подбора питательных сред – соотношение источников С и N – 20:1

Макроэлементы:

Фосфор:

стимулирует проницаемость ЦПМ, участвует в трансформации энергии и формировании систем, входит в структуру полифосфатов.

Источники: фосфаты или фетаты (соли инозид фосфорных кислот)

Недостаток и избыток ослабляет метаболизм кл. и образование антибиотиков.

Класификация продуцентов антибиотиков по потребностям Р:

1. Высокочувствительные продукты,

Допускается концентрация Р менее 10%

Это продуценты тетрациклина нистатина валкомицина

2. Среднечувствительные.

Допускается 10-15% мг % в среде. Это продуценты стрептомиина, эритромицина

3. Малочувствительные

Допускается концентрация Р 18-200 мг % в среде. Это продуценты грамицидин, новобиотина.

Сульфур:

Содержится в белка в простетических группах некоторых ферментов. При ее отсутствии нарушается биосинтез белка.

S входит в структура нукоторых антибиотиков: цефалоспорины, пеницилины, бацитроцин, низин.

Колебание в среде источника S приводт к изменению биосинтеза антибиотиков.

Калий:

Выполняет такие функции:

- К-Na обмен к клетке

- каталитическая функция

- активатор амилазы и ряду других ферментов

Кальций:

- стабилизирует ЦПМ

- регулирует рН среды

- активирует ферменты

- влияет на усваивание – азота и фосфора клетками.

Магний:

- в хелатном соединении находится в Mg-АТФ

- регулирует активность ферментов

- принимает участие в стабилизации структуры ДНК

- влияет на процесс антибиотикообразования

Микроэлементы:

Входят в состав ферментов и и участвуют пв процессе метаболизма клетки. Также микроэлементы присутствуют в хелатных соединениях.

Железо:

- Играет каталитическую роль

- Входит в состав гемов цитохромов

- Включается в структуру некоторых антибиотиков

Медь:

Принимает участие в образовании некторых ферментных систем в сочетании с белками.

Fe и Cu у некоторызх антибиотиков выступают в роли антагонистов.

Цинк:

- Оказывает влияние на фосфатный и азотный обмены в клетке

- принимает участие в реакции окислительного фосфорилирования.

- имеет калалитическую роль в ДНК-полимеразе

- Участвует в синтезе некторых антибиотиков – хлорамфеникола, пенцицилина, стрептомицина.

Недостаток – может привести к нарушению формулы иРНК и синтеза белка

Кобальт:

Играет рол в биосинтезе антибиотиков – гентамицин и корамицин

Манган:

- Составная часть некоротых ферментов – карбоксилаз, фосфатаз

- Принимает участие в синтезе протеиназ

Галогены:

Играет роль в биосинтезе: тетрациклина, хлорамфеникола