Лабораторные методы поиска продуцентов антибиотиков. Выделение продуцентов антибиотиков. Методы идентификации продуцентов антибиотиков. Первичная оценка антибиотиков.

Выделение продуцентов антибиотиков ведут из различных источников: грунт, вода, воздух, гнойное выделение и так далее. Но прежде необходимо четко определиться с задачей: мы хотим выделить продуцент известного антибиотика, который хорошо описан, но более эффективный, или принципиально новый продуцент антибиотика, который активен в отношении определенной группы микроорганизмов и принципиально новый антибиотик.

В первом случае: из большого количества выделяемых микроорганизмов будут исследоваться только те микроорганизмы, которые продуцируют данный антибиотик. Так как каждый антибиотик образуется одним ли несколькими определенными организмами, так как каждый организм образует один или несколько конкретных антибиотиков, свойства которых генетически закреплены геномом данного микроорганизма, например, продуцент пенициллина – ограничивается в представителях гриба p. Penicillum, грамицидана – Bacillus.

Во втором случае: принципиально новый продуцент и антибиотик, на предмет антибиотикообразования исследуется каждый микроорганизм.

Методы выделения микробов-антагонистов

Существует большое количество методов определения микробов-антагонистов. В первую очередь – правильно подобрать среду для выращивания микробов-антагонистов. Если мы ищем антагонистов среди актиномицетов, то используют среды Гаузе или Чапека, рН 6.8-7.1 после стерилизации, температура культивирования характерна для почвенных микроорганизмов – 27⁰С. Есть термофильные актиномицеты – 55-60⁰С. Среди актиномицетов есть ацидофильные, рН 3.5-6.5 – противогрибные антибиотики как правило. Также встречаются галофильные – растут в среде до 10% NaCl.

Бактерии: подавляющее большинство истинных бактерий растут богатые питательные среды – сусло-агар, МПА, рН 7, а температура определяется в зависимости от места выделения (почва, вода – 27-30⁰С, клинические изоляты – 37⁰С).

При изучении продукции антибиотиков очень важно понять, что среда, которая обеспечивает рост микроорганизмов-продуцентов, не всегда обеспечивает синтез антибиотика (в большей степени). Наиболее богата продуцентами почва.

Методы выделения:

1. Высев почвенной взвеси в воде на поверхность агаровой пластинки.

Навеска почвы растирается в пыль и переносится в колбу со стерильной водой. Взвесь встряхивают и из водной суспензии проводят ряд последовательных разведений, которые высеваются на чашку Петри с соответствующей средой. Полученные колонии переносят в пробирки для последующего изучения.

2. Высев почвы на питательный агар, засеянный тест-культурой. Газоном выращивают культуру – переливают суспензию, среда должна быть разлита ровным слоем, агар застывает ровным слоем, несколько минут после посева газоном, пропитается, не проращивая культуру вносят маленькие кусочки почвы, ставят в термостат, вокруг – зона задержки роста, где антагонисты.

Отбираем этот кусочек почвы, переносим в небольшой объем воды и выделяем чистые культуры, которые исследуются на антагонистическую активность.

3. Метод центрифугирования почвенной суспензии. Обычно используется для разделения спор актиномицетов от бактерий. 3000 об\мин. в течении 20 минут, оседают клетки бактерий и споры грибов, а споры актиномицетов остаются в супернатанте и высевают надосадочную жидкость. Можно получить культуру актиномицетов.

4. Использование питательной среды, содержащей антибиотик. Если мы ищем среди грибов, используют антибиотики, подавляющие бактерии, убираем грибы, актиномицеты – в среду антибиотик подавляет развитие бактерий и грибов и наоборот.

Определение спектра действия антибиотика продуцента.

1. Метод перпендикулярных штрихов. В чашку Петри на поверхность соответствующей питательной среды штрихом высевают продуцент, этот продуцент выращивают в термостате (определенное время) и после выращивания культуры периодически подсевают различные штаммы микроорганизмов, но не касаясь продуцента (как можно ближе) – по зонам задержки роста судят о спектре действия данного продуцента.

Недостаток – тест-культуры бактериальные, а продуценты среди грибов и актиномицетов – среды другие. Используют смешанные среды (модифицированная среда Чапека – актиномицеты и бактериальные культуры). Иногда используют модифицированный метод.

2. Модифицированный метод перпендикулярных штрихов. Суть – газоном на поверхность питательной среды высевают продуцент и подращивают в термостате, после проращивания скальпелем стерильно в пламени горелки вырезается среда – половина, удаляем на оставшейся половине – МПА, после застывания высевают тест-культуру.

3. Метод агаровых блоков:

Наш продуцент выращивают газоном на чашках Петри, к количеству чашек с таким продуцентом – пробочным сверлом (трубка и груша) выбивают блок и переносят в чашку, засеянную тест-культурой. В этой тест-культуре тоже делают отверстие, но чуть большее, посеянная тест-культура не выращенная. Вставляем блоки продуцента (разные блоки от разных продуцентов) и тест-культур тоже много. По зонам задержки роста определяют спектр действия.

4. Если продуцент культивируется на жидкой питательной среде и антибиотик эктсрагируется во внешнюю среду, то можно использовать для определения метод бумажных дисков. Высевают не подращивая – накладывают диски стерильно вырезанным дыроколом, промачивают культуральную жидкость соответствующего продуцента (но чтобы не было излишков воды) и смотрим задержки роста.

Идентификация продуцента

Достаточно сложная задача. Для идентификации нужно изучить очень много признаков.

Первая группа – визуальные:

- морфологические (форма колонии, консистенция, размеры, форма клеток, наличие спор, спороносцев, жгутиков и капсул)

- культуральные (характер роста на различных средах, наличие пигмента, который экстрагируется в среду или обнаруживается в структуре колоний, отношение к температуре, рН, кислороду и т.д.)

- физиологические признаки (способность разжижать желатин, осуществлять пептонизацию молока и т.д.)

Вторая группа - биохимические особенности (ферменты, определение типичных продуктов обмена – антибиотики, спирты и др., основные катаболические пути утилизации углеводов – дыхание, неполное окисление и т.д.)

Третья группа признаков – генетические, учитывается соотношение ГЦ:АТ пар, методы гибридизации ДНК-ДНК, нуклеотидные последовательности 16S-рРНК в методе ПЦР (не для всех штаммов имеются праймеры).

Серологические признаки – наличие антигенов, которые позволяют диагностировать (дифференциировать) виды, близко стоящие друг к другу.

Дополнительный признак – чувствительность бактерии к различным бактериофагам или актинофагам. Недостаток: среди актинофагов встречаются как специфические, так и полифаги (могут лизировать близкородственные актиномицеты или относящиеся к разным видам и родам).

Идентификация антибиотика и его активности

Метод перекрестного антагонизма – основан на том, что микробы-антагонисты одного вида не подавляют друг друга.

Метод использования устойчивых форм организмов к определенному антибиотическому веществу – основан на сравнении спектра действия изучаемого продуцента со спектром действия уже хорошо изученного (близкородственные организмы имеют близкий спектр действия).

Самым удобным способом является хроматографический анализ. Хроматография была открыта еще в 1903 году (Цвет). Позволяет определить антибиотик на уровне культуральной жидкости.

Суть метода: на полоске хроматографической бумаги (длиной 20-30 см и шириной 1 см) наносится испытуемый антибиотик, пятно подсушивается на воздухе и полоску бумаги помещают в бак или цилиндр, который насыщен растворителем. Время помещения составляет 10-20 часов. После окончания полоску извлекают и производят идентификацию (определяют место расположения пятна антибиотика). Есть много методов для такой идентификации: биологические, химические и физические.

Биологический: после извлечения полоски подсушиваются на воздухе или в вытяжном шкафу и накладываются на агаровую пластину, которая предварительно засеяна тест-культурой (чувствительными к данному антибиотику микроорганизмами), подсушенной, но не подрощенной. Между полосками должны оставаться расстояния. Агаровую пластину помещают в термостат. Результат: там, где имеется пятно антибиотика, он будет диффундировать в агар с бумаги и угнетать жизнедеятельность микроорганизма. Преимущества: позволяет выделить самые активные антибиотические вещества для дальнейшей идентификации.

Химический: основан на взаимодействии антибиотика с определенными химическими веществами, которые дают окрашивание в зоне расположения пятна.

Физические методы: выявление люминисценции пятна в УФ-свете, поглощение УФ пятном и др.

Обычно результатом любой хроматограммы является определение коэффициента R_f. Это коэффициент, который определяется отношением расстояния, которое проходит пятно изучаемого вещества к расстоянию фронта растворителя.

R_f=L_аб/L_фр

По значению R_f можно различать группы химически родственных антибиотиков, и до некоторой степени отличают также антибиотики внутри групп.

В любом случае необходимо сделать минимум 3 хроматограммы или даже больше. Для того, чтобы была воспроизводимость результатов при повторах, необходимо соблюдать постоянство качества бумаги, температуры, растворители (одной чистоты), степени очистки антибиотика, составных частей культуральной жидкости.

Определение активности антибиотиков

Величины биологической активности антибиотиков обычно выражают в условных единицах, которые содержатся в 1 мл раствора или в 1 мг препарата. Если имеется антибиотик, полученный в чистом виде, то его активность выражают в мкг\мг препарата или мкг\мл препарата.

За единицу антибиотической активности принимают минимальное количество антибиотика, которое способно подавить развитие или задерживать рост определенного числа тест-микроба (стандартного штамма) в единице объема питательной среды. За единицу активности пенициллина принимают минимальное количество антибиотика, которое способно задерживать рост St.aureus 209 в 50 мл бульона. Для стрептомицина за единицу активности принимают минимальное количество антибиотика, который задерживает рост E.coli К12 в 1 мл бульона.

Количественное определение антибиотика в культуральной жидкости или в других растворах осуществляется несколькими методами: биологическими, химическими и физико-химическими.

Наиболее распространенным, удобным и достаточно точным является биологический метод. Его можно применять к любым антибиотикам. В основу положен метод серийных разведений. Берут стерильный бульон, который мерно разливается в пробирки, в этом бульоне делается последовательно серийное разведение антибиотика (на уровне культуральной жидкости или раствора) с различным шагом – 2х, 10х, 100х. После этого вносится тест-культура в определенном количестве и инкубируют. На следующий день определяют единицы активности по тому максимальному разведению, которое задерживает рост тест-культуры, и это разведение принимают за единицы активности данного антибиотика. Более точный метод определения при большом шаге разведения: средняя концентрация между последним минусом и первым плюсом (минус – отсутствие роста, плюс – наличие роста). Методом серийных разведений можно определять активность антибиотика и в весовых единицах – мкг\мл. Но это только в том случае, если мы точно знаем, какой антибиотик мы изучаем. Делается тоже ряд разведений (опытного и стандартного антибиотика, который берется в определенной известной концентрации) с последующим посевом, через некоторое время отмечается то максимальное разведение, которое дает задержку роста, и концентрацию антибиотика определяют по отношению разведения испытуемого раствора к разведению стандартного антибиотика, и умножают на концентрацию стандартного антибиотика. Например:

Антибиотик	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32
Исследуемый	-	-	-	+	+
Тест С=10мкг/мл	-	+	+	+	+

C_{исслед.}= (Розвед. _{исслед.} / Розвед. _тест)* С_тест = 8/2*10=40мкг/мл

Этот метод сопоставим только в том случае, если эксперимент проводится с соблюдением стерильности (асептики), используют одни и те же среды для разведения, вносятся одни и те же количества клеток, соблюдается длительность инкубации, температура и т.д.

Еще одна разновидность биологических методов – диффузный метод. Основан на том, что антибиотики могут диффундировать в агар и вызывать зону задержки роста тест-культуры. Величина зоны задержки роста будет определяться составом агаровой пластины, рН, температурой, а также химической природой антибиотика, его молекулярной массой, и концентрацией антибиотика (чем выше концентрация, тем больше зона задержки). На основе диффузных методов основываются метод с использованием металлических цилиндров, метод с использованием лунок в агаре, метод с использованием бумажных дисков.

Метод с использованием металлических цилиндров: на поверхность агара, засеянного тест-клуьтурой, вставляют стандартные металлические цилиндры, которые сделаны из алюминия или нержавеющей стали, и вносят в них определенное количество испытуемого раствора, чередуя его с антибиотиками известной концентрации. Для известного антибиотика строят стандартную (калибровочную) кривую, где по оси ординат отмечают зону задержки роста в мм, а по оси абсцисс – соответствующую концентрацию антибиотика. По этой стандартной кривой определяют концентрацию исследуемого антибиотика в культуральной жидкости.

Метод с применением лунок в агаре основан на том же принципе. Лунки в агаре пробивают специальным пробочным сверлом, дно лунок герметизируют одной каплей расплавленного агара. Затем в эти лунки помещают разные концентрации стандартного и испытуемого антибиотика.

Метод с использованием бумажных дисков используют если антибиотик находится в культуральной жидкости. Из фильтровальной бумаги дыроколом вырезают диски, их стерилизуют, и стерильным пинцетом смачиваются в разных концентрациях антибиотика и накладываются на засеянную тест-культуру.

Химические и физико-химические методы. Преимущество: быстрые. Недостаток: уступают в точности биологическим методам, не ко всем антибиотикам можно использовать.

Относят колориметрические и спектрофотометрические методы. В основу колориметрических методов положен принцип превращения препарата или его группировок в окрашенные соединения. Спектрофотометрический метод основан на том, что антибиотики имеют характерные спектры поглощения в видимом свете (360-720 нм) и\или в УФ-области (200-360 нм). Для этого также обязательно строится калибровочная кривая для стандартного антибиотика с разными концентрациями (по оси ординат отмечают значение спектрофотометра – ОД).

Химические методы определения антибиотиков применяются очень редко. Существует несколько методик определения концентрации пенициллина, в основу которых положено поглощение йода продуктами гидролиза антибиотика.