2. Приготування гістологічного препарату:

Після забору матеріалу виконується його підготовка до дослідження, що включає в себе ряд етапів.

1. Фіксація (від лат. fixatio - Закріплення) - фрагмент тканини обробляють за допомогою рідини-фіксатора, в ролі якого найчастіше виступає формалін, рідше - спирти, пікринова кислота та ін Така обробка запобігає розпад клітин і руйнування структури тканини під дією власних ферментів клітин і процесів гниття, таким чином зберігаючи прижиттєву структуру і роблячи можливим вивчення тканини. Принцип дії фіксуючих рідин заснований на швидкій загибелі клітин та коагуляції білка. Найбільш поширений тип фіксації - Іммерсійна фіксація (від лат. immersio - Занурення), при якій фрагмент тканини цілком занурюється в розчин; в експериментальних умовах також використовують перфузійну фіксацію (від лат. perfusio - Вливання), при якій фіксатор вводять через судинну систему. ^[1] При цьому використовують як технічний формалін (марка ФМ ГОСТ 1625-89), так і підготовлений ("забуференной" формалін), який відрізняється більшою стабільністю - не утворюється білий осад, властивий технічному формаліну при температурі нижче 40 С.

2. Проводка - процес дегідратації (зневоднення) фрагмента тканини і просочення його парафіном. Цей етап забезпечує ущільнення тканини, яке, в свою чергу, необхідно для отримання зрізів (якщо тканина буде надмірно м'яким, то при мікротомірованіі вона буде "м'яти", утворюючи складки, розриви та інші артефакти, які роблять її непридатною до вивчення). Традиційно проводку здійснювали шляхом послідовного занурення тканини в розчини ксилолу і етилового спирту, ^[1] проте такий метод має ряд істотних недоліків, як-то: трудомісткість, тривалість (до чотирьох діб) ^[2], випаровування реагентів в повітря лабораторії (що небезпечно для співробітників лабораторії, так як ксилоли утворюють вибухонебезпечні пароповітряні суміші, викликають гострі та хронічні ураження кровотворних органів, при контакті зі шкірою - дерматити), ^[3] а також нестабільна якість одержуваної тканини, залежне від людського фактора, а саме дій лаборанта. Для вирішення проблем такого роду лабораторії використовують альтернативні реагенти, такі як ізопропанол, що є нетоксичним, а також апарати - гістопроцессори, що мають закритий контур і таким чином не допускають випарів у повітря лабораторії. Шляхом використання гістопроцессоров також можна значно зменшити час проводки в порівнянні з ручним методом (до однієї години при використанні гістопроцессора Xpress 120 ^[4]) за рахунок застосування вакуум-інфільтраційної і мікрохвильовою методик.

3. Заливка - процес створення блоку, достатньо твердого, щоб бути придатним для різання ( мікротомірованія). Виконується шляхом заливання фрагмента тканини рідким парафіном, целлоидин, пластмасою або спеціальними середовищами для заливки. Потім залиту тканину остуджують до затвердіння блоку. Целлоидин в даний час практично не використовується; чистий парафін також має низку недоліків, які роблять його непридатним для дослідження - при його затвердінні утворюються кристали, які зменшують його обсяг на 5-10%, що, в свою чергу, веде до деформації тканини ^[5], а також через кристалічної структури він легко кришиться при різанні. Тому найчастіше для виготовлення блоків користуються спеціальними заливальним середовищами, які представляють собою суміш парафінів з присадками у вигляді рисового, бджолиного воску або полімерів. Ці присадки надають парафіну еластичність, що не дає йому кришитися при різанні. Щоб створити гомогенну середовище для заливки, віск і парафін розплавляють, охолоджують і ретельно перемішують, повторюючи всю процедуру 5-10 разів. Це досить трудомісткий процес, якість одержуваної середовища нестабільно, тому деякі лабораторії користуються готовими середовищами для заливки, виготовленими в заводських умовах і не вимагають додаткової гомогенізації.

4. Різка, або мікротомірованіе, являє собою виготовлення тонких зрізів на спеціальному приладі - мікротоми. Товщина зрізів, призначених для світлової мікроскопії, не повинна перевищувати 4 - 5 мкм, для електронної - 50 - 60 нм.

5. Фарбування зрізів дозволяє виявити структуру тканини за рахунок неоднакового хімічної спорідненості різних елементів тканини до гістологічних барвників. Наприклад, забарвлення гематоксиліном і еозином дозволяє виявити кислі структури тканини, такі як ДНК і РНК, за рахунок їх зв'язування з гематоксиліном, які мають лужну реакцію, і цитоплазму клітин, що зв'язується з еозином ^[6] (Основна стаття - забарвлення гематоксиліном і еозином). Перед фарбуванням виконується монтування зрізу на предметне скло. Для уникнення формування складок зріз після мікротомірованія поміщають на поверхню підігрітої води, де він розправляється, а потім вже на скло. Фарбування, як і всі інші стадії процесу виготовлення гістологічного препарату, може виконуватися вручну й автоматично. Розрізняють традиційне фарбування та імуногістохімічне.

6. Висновок зрізів являє собою приміщення пофарбованого зрізу, монтувати на предметному склі, під покривне скло з використанням середовища для висновку, що має коефіцієнт заломлення, близький до такого у скла - канадський бальзам, полістирол, спеціальні середовища для висновку. Ув'язнений препарат можна зберігати досить тривалий кількість часу (виняток - при використанні полістиролу препарат поступово втрачає прозорість, а сам полістирол тріскається).

Мікротом (рос. микротом, англ. microtome, нім. Mikrotom) — прилад, за допомогою якого одержують надтонкі зрізи тканини, фіксованої в парафіні, з подалшим її перенесенням на слайд, що дає можливість їх фарбувати для подальших досліджень за допомогою мікроскопу. Дозволяє отримувати зрізи товщиною 1 — 60 мкм.

Мікротоми, що дозволяють одержувати зрізи товщиною 10-100 нм отримали назву ультрамікротомов. Ультрамікротоми, суміщені з кріокамери для приготування зрізів в умовах низьких температур, отримали назву кріоультрамікротомов. Вони використовуються для підготовки зразків для електронної і скануючої зондової мікроскопії.

Мікропрепарат - предметне скло з розташованим на ньому об'єктом, підготовленим для дослідження під мікроскопом. Зверху об'єкт зазвичай накривається тонким покривним склом. Розміри предметних стекол (25 на 75 мм) і їх товщина стандартизовані, це полегшує зберігання препаратів і роботу з ними.Розрізняють постійні препарати, в яких об'єкт, накритий покривним склом, укладений в канадський бальзам або іншу прозору тверднучого середу, і тимчасові, яких заливання виробляється в гліцерин-желатин, або об'єкт міститься в фізіологічний розчин або просто в воду. Постійні препарати можуть зберігатися без змін багато десятиліть.Залежно від характеру досліджуваного об'єкта, використовуються різні типи препаратів.Тотальні препарати. Приготовляются з дрібних організмів або невеликих їх частин. Часто вимагають додаткової обробки просвітлюючих розчинах. Зневоднені тотальні препарати можуть полягати постійні середовища. Мазки. Застосовуються гематології при вивченні крові, для вивчення бактерій і найпростіших. Можуть приготавливаться з тканинних елементів. Вологі мазки фіксують, не даючи досліджуваного матеріалу висохнути. Потім препарат готують так само, як наклеєні на скло зрізи.Сухі мазки висушують не фіксуючи.Зрізи виготовляються з фіксованих і залитих пластичний матеріал (парафін, акрил) об'єктів на мікротоми. Для швидкого отримання зрізів без тривалої процедури зневоднення застосовують заморожуючий мікротом.Шліфи приготовляются з матеріалів, що не піддаються різанню на мікротоми. Препарат-відбиток мікропрепаратів, виготовлений 2 - 3 дотиками чистого предметного скла до свіжого зрізу об'єкта, напр., біоптату, шматочків органів трупів людей і тварин, харчових продуктів щільної консистенції (м'ясо, риба, ковбаса, шинка), ділянці шкіри або слизової оболонки, до колоній грибів , актиноміцетів, іноді еубактерій. Препарат висушують, фіксують рідким фіксатором, фарбують, мікроскопіруют. Дотик має бути строго вертикальним тривалістю 1 -2 с.

Етапи виготовлення і контрастування гістологічних препаратів:

1) Відбір матеріалу з різних органів і тканин здійснюється з урахуванням особливостей їх анатомічної і гістологічної будови.

2) Фіксація матеріалу забезпечує стабілізацію клітинних і неклітинних структур, запобігає їх саморуйнуванню (аутоліз).

Фіксаторами можуть бути різні рідкі хімічні речовини. Розрізняють фіксатори прості (спирти: етиловий і метиловий, розчин формальдегіду, глутаральдегід, кислоти осмієва, пікринова, оцетова, розчини деяких солей важких металів) і складні, які складаються з декількох простих фіксаторів (рідина Карнуа, Буена та ін.).

3) Ущільнення матеріалу досягається тим, що матеріал просочують щільнішою речовиною для запобігання деформації структур досліджуваного об'єкту при виготовленні з нього дуже тонких зрізів. Для цього в світловій мікроскопії застосовують розчинений в ароматичних вуглеводнях і розплавлений парафін, спиртовий розчин целоїдину або заморожують об'єкт в кріостаті.

У електронній мікроскопії ущільнення об'єкту досягається просоченням його епоксидними смолами.

4) Для виготовлення зрізів застосовують мікротоми (санні, роторні, заморожуючі) і ультратоми. Для цього використовують сталеві мікротомні ножі, виготовлені з високоякісної загартованої сталі. Для отримання ультратонких зрізів застосовують ножі із спеціального шведського скла або алмазів.

5) Контрастування гістологічних зрізів здійснюється спеціальними фарбниками, які підрозділяються на 3 основні групи:

Основні (лужні) фарбники (гематоксилін, азур, сафранін, основний коричневий, толуїдіновий синій, галлоцианін, тіонин, метиловий зелений, метилвіолет і ін.);

Кислі фарбники (эозин, ерітрозин, кислий фуксин, пікринова кислота, світлий зелений і інші);

Спеціальні фарбники офарблюють тільки певні структури клітин або окремі хімічні з'єднання в клітинах і міжклітинній речовині (осмієва кислота, азотнокисле срібло, хлорне золото, судани III і IV, орсєїн, муцикармін і ін.).

Здатність різних цито - і гістологічних структур забарвлюватися тими або іншими фарбниками називається тінкторіальною властивістю (від лат. tinctura - настоянка).

6) Заключеня забарвлених зрізів здійснюється при приготуванні тимчасових мікропрепаратів у воду, гліцерин, гліцерин-желатину, а для приготування постійних препаратів - в бальзам, полістирол, спеціальні смоли (дамар-лак та ін.).

3. Гістохімія-розділ гістології, що вивчає хімічні властивості тканин тварин і рослин. ГІСТОХІМІЯ використовується для визначення в тканинах різних речовин: ферментів, різних класів жирів, білків, глікопротеїнів, вуглеводів, металів. Наприклад, для того щоб встановити певний вид дистрофії необхідне тільки гістохімічне дослідження на ліпіди, білки, вуглеводи тощо. Також деякі види гістохімічних забарвлень поєднують з експрес-діагностикою на заморожених зрізах. Радіоавтографія — метод, за допомогою якого вивчають розподіл радіоактивних речовин, накладаючи на досліджуваний об'єкт чутливу до іонізуючого проміння фотоемульсію; радіоактивні речовини при цьому немовби самі себе фотографують.

5. Тканинний рівень представлений тканинами, що об'єднують клітини певної будови, розмірів, розташування і подібних функцій. Тканини виникли в ході історичного розвитку разом з багатоклітинністю. У багатоклітинних організмів вони утворюються в процесі онтогенезу як наслідок диференціації клітин. У тварин розрізняють кілька типів тканин (епітеліальна, сполучна, м'язова, нервова, а також кров і лімфа). У рослин розрізняють меристематичну, захисну, основну і провідну тканини. На цьому рівні відбувається спеціалізація клітин. . Тканина - сукупність клітин та міжклітинної речовини, подібних за будовою, функціями, які мають спільне походження. В організмі людини за морфологічними і фізіологічними розрізняють 4типи тканин: епітеліальна, сполучна, м’язова, нервова. Причина відмінностей між тканинами полягає в тому, що їх клітини структурно спеціалізовані для виконання певних функцій, необхідних організму. Симпласти у тварин - будова тканини, що характеризується відсутністю кордонів між клітинами і розташуванням ядер в суцільній масі цитоплазми. Сімпластіческое будова характерно для поперечно-смугастих м'язових волокон, деяких найпростіших (інфузорій, форамініфер, багатоядерних стадій розвитку малярійних плазмодіїв та ін), зародків ряду комах на ранніх стадіях розвитку. Симпластам утворюється в результаті злиття кількох клітин або ділення ядер без подальшого цітокінезаУ рослин симпластам, або сінцітіем, називають єдину систему протопластів рослинних клітин, що об'єднуються в одне ціле численними плазмодесмамі. Симпластам є одним із шляхів, що забезпечують транспорт речовин у рослині (сімпластіческій транспорт). Сінцітій - тип тканини у тварин, рослин і грибів з неповним розмежуванням клітин; відособлені ділянки цитоплазми з ядрами зв'язані між собою цитоплазматичними перемичками (наприклад, зародкова сполучна тканина - мезенхима).Являє собою кілька клітин, що злилися один з одним, і містять кілька ядер.Зокрема, міокард людини являє собою функціональний сінцітій: клітини серцевого м'яза - кардіоміоцити - об'їдені між собою вставними дисками, що забезпечують щілинні контакти з низьким опором. Завдяки низькому опору вставних дисків потенціал дії вільно розповсюджується від одного кардиомиоцита до іншого, що забезпечує синхронне скорочення м'яза. Серце складається з двох сінцітіев - передсердного, утвореного м'язовими стінками обох передсердь, і шлуночкового, утвореного м'язовими стінками шлуночків, розділених фіброзною перегородкою. Існування в серці двох функціональних сінцітіев забезпечує дію послідовне скорочення передсердь і шлуночків у серцевому циклі.