Лабораторна робота №1
Тема: Методи анатомічних досліджень.
Мета: Ознайомитись із будовою та принципом роботи збільшувльаних приладів, методами анатомічних досліджень.
Теоретичні питання:
1. Збільшувані прилади, що використовуються в аналітичних дослідженнях.
2. Типи препаратів і фіксація матеріалу.
3. Виготовлення зрізів.
4. Фарбування препаратів.
5. Методи мікроскопічних досліджень.
6. Виміри об’єктів під мікроскопом.
Завдання:
1. Ознайомитись із будовою збільшуваних приладів. Навчитись користуватись світловим мікроскопом.
2. Вивчити типи препаратів та методи фіксації матеріалу.
3. Навчитись виготовляти зрізи.
4. Ознайомитись із методикою фарбування препаратів.
5. Засвоїти методи мікроскопічних досліджень.
6. Навчитись виміряти величину досліджуваних об’єктів під мікроскопом.
Основні відомості
(за Брайоном О.В., Чикаленко В.Г., 1992 р.).
Хід роботи:
1. Збільшувані прилади.
Розмір рослинних клітин настільки малий (визначається в мікрометрах), що їх не можна побачити неозброєним оком. Тому для дослідження внутрішньої будови рослин використовують світлові та електронні (просвічуючий, скануючий) мікроскопи.
Світловий мікроскоп дає змогу виявити порівняно крупні структури в клітинах — оболонку, ядро, вакуолі, пластиди, мітохондрії, різні включення та особливості будови тканин і органів. З допомогою його можна отримати збільшення в 1500 разів, що обмежується роздільною здатністю найдосконаліших об'єктивів. Роздільна здатність електронних мікроскопів значно більша — до 0,5 нм. Тому вони застосовуються для виявлення ультратонкої організації клітин і тканин, даючи збільшення до 250 000.
Поєднання мікроскопічного методу дослідження з мікрохімічними реакціями (цито- і гістохімією) дає змогу виявити локалізацію речовин в рослинних структурах, а також певною мірою і обмінних процесів.
На практичних заняттях з анатомії рослин використовують головним чином світловий мікроскоп (рис. 1). З будовою оптичного мікроскопа і окуляр-мікрометра та правилами роботи на них студенти знайомляться на попередніх практичних заняттях з інших дисциплін. Тому у даному практикумі їм пропонується контрольне завдання: зробити відповідні підписи до позицій на рис. 1 .
Мікроскоп складається з оптичної частини (освітлювальна система, об'єктиви і окуляри, вмонтовані в тубусі) та механічної (штатив-основа, предметний столик, тубусоутримувач з механізмом для його переміщення). До освітлювальної системи належать розташовані під столиком мікроскопа дзеркальце і конденсор з ірисовою діафрагмою. Плоскою стороною дзеркальця направлять світло на препарат при роботі з об'єктивами 60X і 90X, угнутою — 8Х і 10Х, 20Х і 40х.
Конденсори складаються з двох-трьох лінз у циліндричній оправі і поділяються на різні типи залежно від метода спостереження в мікроскопі: конденсор світлого поля, конденсор темного поля, конденсор з апертурною діафрагмою для косого освітлення тощо.
Під діафрагмою є гніздо для світлофільтрів і світлорозсіювальних матових скелець, які застосовуються при роботі з штучним освітленням звичайними прозорими лампами.
Об'єктиви мають кілька лінз, що вкручені в револьверну оправу. На заняттях звичайно працюють з об'єктивами 8Х і 40Х. Імерсійний об'єктив — 90Х використовують порівняно рідко. Він потребує нанесення на покривне скельце імерсійної рідини, зокрема кедрової олії, водного розчину 74%-го гліцерину, монобромнафталіну, дистильованої води.
Рис. 1. Сучасний світловий мікроскоп
Кількість лінз в окулярі невелика, часто їх дві. Верхня лінза — спостережувальна, нижня фокусує зображення. Діафрагма окуляра визначає поле зору. Найчастіше користуються окулярами 10Х і 15X. Їх вставляють у верхню частину тубуса, який рухається зверху вниз і навпаки за допомогою макро- і мікрометричної гвинтових систем.
Рухаючи препаратоводієм предметне скельце на столику мікроскопа, розташовують препарат у центрі поля зору. Потім рівномірно освітлюють його денним розсіяним світлом або від лампи освітлювача, використовуючи в разі потреби світлофільтри. При переведенні з малого на більше збільшення зображення препарату стає нечітким. Різкості зображення добиваються трохи опускаючи тубус мікроскопа з допомогою гвинтів грубої наводки, а також мікрогвинтами.
З метою дослідження надто дрібних структур рослинних клітин або ультратонкої організації органел, які видимі і в світловому мікроскопі, застосовують просвічуючий або скануючий електронні мікроскопи.
Просвічуючий електронний мікроскоп за принципом одержання зображення подібний до світлового, але для освітлення об'єктива замість світла використовується пучок електронів. їх прискорюють з допомогою великої різниці потенціалів, яка досягає 50 000— 100 000 В. Пучок електронів фокусують двома конденсорними електромагнітами. Всередині колони створюють глибокий вакуум, щоб звести до мінімуму розсіювання електронів. Зображення реєструється на фотопластинці, яка розташована під екраном. Мікропрепарат на спеціальній плівці-підложці розміщується всередині колони. В зв'язку з тим що для проходження електронів потрібний глибокий вакуум, в електронному мікроскопі не можна розглядати живі об'єкти. Виготовлення препаратів для електронної мікроскопії потребує спеціальної технології.
Скануючий (растровий) електронний мікроскоп використовують для дослідження поверхні рослинних структур. У цьому приладі точно зфокусований пучок електронів діаметром близько 10 мкм відбивається від зразка, скануючи в певній послідовності поверхню об'єкта, на яку попередньо напилюють тонкий шар металу. Тривимірне зображення структурних елементів створюється за допомогою електронної катодної трубки. Щоб електрони не проникали всередину зразка, прискорююча напруга не перебільшує 20 000 - 30 000 В. Роздільна здатність його нижча, ніж у проникаючого мікроскопа (5 - 20 нм), але він дає досить значну глибину різкості, що створює ефект тривимірності.
Електронний мікроскоп високої напруги (високовольтний) почали застосовувати в біології недавно. В ньому створюється сильне прискорення електронів під дією дуже високої напруги (50000-1000000В), що дає змогу їм проникати крізь порівняно товсті зрізи (1 - 5 мкм) і досліджувати весь об'єм клітини. При цьому при високій роздільній здатності одержують тривимірне зображення структур.
Для світлової і електронної мікроскопії проводять спеціальну обробку рослинного матеріалу. Виготовлення препаратів є однією з найважливіших ланок анатомічних досліджень.
2. Типи препаратів і фіксація матеріалу.
Препарати поділяють на живі і фіксовані, тотальні і зрізи, давлені і мацеровані, тимчасові і постійні. Препарат називають тотальним, якщо його розглядають цілим. Прикладом може бути листок елодеї, відбитки покривної тканини тощо. Зрізи роблять на живому і фіксованому матеріалі. Розрізняють поверхневі, поперечні та поздовжні (радіальні- і тангентальні) зрізи. Тангентальними називаються зрізи, які паралельні радіальній площині органа.
Давлені препарати готують механічним руйнуванням тканин шляхом їх обережного роздавлювання. Мацерацію проводять для одержання окремих клітин. Відомі різні способи розриву зв'язків між клітинами. Для мацерації готових зрізів звичайно використовують 10 - 30 %-й розчин хромового ангідриду, в якому їх витримують від однієї до п'яти хвилин.
Для мацерації трав'янистих нездерев'янілих частин рослин часто застосовують також метод Манжена. Для цього частини рослин занурюють на 24 год в суміш 96 %-го спирту і соляної кислоти у співвідношенні 3,5:1, а потім на 24 год в 10 %-й розчин аміаку. Шматочки тканини після надавлювання пінцетом повинні легко розпадатися на окремі клітини. Якщо мацерація не відбулася, концентрацію аміаку підвищують до 30 %.
Мацерацію тканин плодів і насіння проводять слабкими розчинами лугів (1 - 10 %-й КОН або NaOH) при кімнатній температурі протягом доби. Перед зануренням у розчин сухий матеріал замочують у воді.
Для мацерації деревини використовують суміш Шульца: бертолетова сіль — азотна кислота. Шматочки деревини розміщують на дні пробірки. Зверху на них насипають бертолетову сіль так, щоб вона покрила весь матеріал. Сіль змочують кількома краплинами концентрованої НNO3. Пробірку підігрівають. Коли шматочки деревини побіліють, а пари перестануть виділятись, їх переносять у стакан з водою. Водою промивають кілька разів. Мацерований матеріал зберігають у спирті.
Тимчасові препарати виготовляють із живого і фіксованого матеріалу. Під час спостереження вони знаходяться в воді або водних розчинах гліцерину, сахарози тощо. Виготовлення постійних препаратів для світлової мікроскопії пов'язане з досить складною обробкою досліджуваних об'єктів. Після фіксації матеріал промивають водою і зневоднюють за допомогою послідовно збільшених концентрацій етанолу. Потім проводять заміщення його на розчинники парафіну і, нарешті, заключають матеріал у парафін. Із нього від руки або на мікротомі роблять зрізи, які депарафінують, забарвлюють відповідними барвниками, зневоднюють і заключають на предметних скельцях у канадський бальзам. При виготовленні постійних препаратів для електронної мікроскопії обробка матеріалу ще складніша.
Фіксація матеріалу забезпечує збереження первісної структури об'єкта. При цьому тканини настільки ущільнюються, що з них можна виготовляти тонкі зрізи. Щоб фіксуючі суміші краще проникали в клітини, матеріал подрібнюють. Для нездерев'янілих об'єктів у світловій мікроскопії досить поширені фіксатори Навашина і Карнуа.
Фіксатор Навашина: льодова оцтова кислота - 40 %-й формалін - 1 % хромова кислота (1:4:10). Готують його напередодні фіксації. Він не спричинює деформації тканин. Час обробки матеріалу 12 - 24 год. Придатний для дослідження тонких структур ядра і цитоплазми, але руйнує мітохондрії. Після фіксації матеріал промивають водою і зневоднюють.
Фіксатор Навашина може бути модифікований. Тоді він містить більш слабкі концентрації оцтової кислоти, формальдегіду, а часом і хромової кислоти.
Фіксатор Карнуа: 96° етиловий спирт — хлороформ — льодова оцтова кислота (6:3:1). Готують безпосередньо перед роботою. Час фіксації 3 - 12 год. Спричинює нерівномірне стискання тканин. Після обробки матеріал промивають 96°-м спиртом до зникнення запаху ацетату і зберігають у 70°-му етанолі. Цитологічні картини менш чіткі, порівняно з розчином Навашина. Мітохондрії руйнуються. Фіксатор Карнуа використовують для конусів наростання, бруньок, дрібних корінців, листків, бутонів, зав'язей, пиляків, насінних зачатків і частин насіння.
При необхідності збереження в клітинах мітохондрій застосовують фіксатор Левицького або Рего. Фіксатор Левицького: 1%-на хромова кислота — 10 %-й формалін від продажного (3:17). Час консервування — 2 доби. Потім об'єкт протягом 24 год промивають у проточній воді. Застосовують також і іншу суміш Левицького: 1% хромова кислота - 2 % осмієва кислота — вода (15:2:18). Час фіксації 2 тижні.
Фіксатор Рего: 3 %-й біхромат калію — продажний формалін (8:2). Час обробки матеріалу — 96 год. у темряві. Суміш щодня замінюють на свіжу. Після цього зразки 3 - 8 днів витримують у 3 %-му розчині К2Сr2О7 з послідуючою промивкою протягом 24 год проточною водою.
Здерев'янілі частини рослин консервують розчином 96 % етанол— гліцерин— вода (3:2:1), а тканини, багаті на слиз,— пікриновою кислотою з додаванням невеликої кількості гліцерину. Для електронної мікроскопії використовують спеціальні фіксатори, зокрема глутаральдегід або суміш глутаральдегіду і осмієвої кислоти, перманганат калію.
Після консервування матеріалу водними фіксаторами його промивають кілька разів у воді, а після спиртових — у 70 - 80,%-му спирті. Це необхідно тому, що до складу більшості фіксаторів входять токсичні речовини, які можуть змінити структуру клітин і тканин, зумовлюючи надмірне ущільнення їх або навіть мацерацію. При фіксації водними сумішами матеріал зневоднюють послідовно збільшеними концентраціями етанолу (20, 40, 60, 80 %), витримуючи його в кожному розчині 30 хв. У 70 - 80 %-му спирті матеріал можна зберігати тривалий час. Для остаточного зневоднення його двічі по одній годині проводять через 96 %-й спирт і двічі через абсолютний. Потім його витримують у розчинниках парафіну — в ксилолі, бензолі, толуолі або хлороформі і, нарешті, вміщують у чистий парафін.
Добрим розчинником парафіну для дрібних об'єктів є хлороформ, а для крупних - бензол і ксилол. Звичайно спочатку матеріал по одній годині витримують у трьох сумішах розчинника з абсолютним спиртом: і частина розчинника+3 частини абсолютного етанолу, 1 частина розчинника+1 частина абсолютного етанолу, 3 частини розчинника +1 частина абсолютного етанолу. Пізніше його двічі промивають (1 - 2 год) у чистому розчиннику і тільки після цього заливають парафіном. Останню операцію проводять протягом доби при температурі 56 - 57 °С у термостаті у витяжній шафі. Після просочування зразки разом з розплавленим парафіном переносять у формочки. З метою виготовлення зрізів на мікротомі готують спеціальні парафінові блоки. Для електронної мікроскопії використовують більш тверді, ніж парафін, речовини — пластмаси або епоксидні (аралдит, епен) і поліефірні (вестопал W) смоли.