- •Глава1.
- •Частьii.Собственныеисследования
- •Глава2. Материалыиметоды…………………………………………502.1.Общаяхарактеристикабольных……………………………………………50
- •Глава3.Результатыисследования………………………………...74
- •Глава4.Обсуждениеполученныхрезультатов…………. 221
- •Списоксокращений
- •Введение Актуальностьпроблемы
- •Научнаяновизнаисследования
- •Практическаязначимость
- •Основныеположения,выносимыеназащиту
- •Внедрениерезультатов работывпрактическоездравоохранение
- •Апробацияработы
- •ГлаваI обзорлитературы
- •ЭтиологияипатогенезИап
- •Классификация,клиническиеособенности иап
- •Пузырчаткавульгарная(Pemphigusvulgaris)
- •Пузырчаткалистовидная(эксфолиативная) /Pemphigusfoliaceus/
- •Паранеопластическаяпузырчатка(Paraneoplasticpemphigus)
- •1.5.1Общиепредставленияомолекулярной фармакологииСгк
- •СтроениеГр:
- •ИзоформыГр:
- •ЛечениебольныхИап
- •АдьювантнаятерапиябольныхИап
- •Азатиоприн
- •ЦиклоспоринA
- •Метотрексат
- •МофетилМикофенолат
- •Циклофосфамид
- •Никотинамидитетрациклин
- •Соли золота
- •Внутривенный иммуноглобулин
- •Пиридостигминабромид
- •Стероиднаярезистентность
- •Механизмы стероидной резистентности на рецепторномуровне
- •Механизмыстероиднойрезистентностинапострецепторномуровне
- •ЧастьIi.Собственныеисследования
- •Глава2.Материалыиметодыисследования
- •Общаяхарактеристикабольных
- •Характеристика больных иап, находившихся поднепосредственнымнаблюдением
- •ИзучениекатамнестическихданныхбольныхИап
- •2.1.3. Изучение клинических данных больных для определениямолекулярныхмеханизмовстероиднойрезистентности
- •МужчиныЖенщины
- •В%соотношении
- •Оборудование
- •Изучениехарактерасвязываниясмембраннымирецепторамипо
- •Исследование связывания меченого сгк внутриклеточными
- •Полимеразно-цепнаяреакцияврежимереальноговремени
- •Описаниеметода:
- •Исследование молекулярных механизмов стероиднойрезистентности напострецепторномуровне
- •Реактивы
- •Оборудование
- •Приготовлениереактивов
- •Полимеразно-цепнаяреакция
- •Определениефакторанекрозаопухолиα (tnf-α)
- •Радиоизотопныйметод
- •Постановкарадиоизотопногометода
- •Жидкостнаясцинтилляционнаярадиометрия
- •Статистическаяобработкарезультатовисследования
- •Глава3.Результатыисследования
- •Ретроспективный анализисторийболезнибольныхИап
- •Общая характеристикаклиническихданныхбольныхИап
- •Количествобольныхв%соотношении
- •% Отр. 52 Положит. 48 46
- •КоличествоСр(-)больныхИап в%соотношении
- •Нетадювантнойтерапии
- •Такимобразом:
- •3.1.2. ХарактеристикастероидчувствительныхбольныхИап
- •КоличествоСр(-)больныхИаПв %соотношении 60%
- •КоличествоСр(-)больныхИап в%соотношении
- •% Отр. 58 Положит. 42 0
- •КоличествоСр(-)больных иаПв%соотношении 80%
- •КоличествоСр(-)больныхИаПв %соотношении 100%
- •Такимобразом:
- •3.1.3.ХарактеристикастероидрезистентныхбольныхИап
- •%Соотношении
- •В%соотношении
- •Онкология
- •Такимобразом:
- •КоличествобольныхИаПв% соотношении 60%
- •КоличествобольныхИаПв% соотношении 100%
- •КоличествобольныхИаПв% соотношении
- •КоличествоСр(-)больныхИаПв %соотношении 80%
- •Такимобразом:
- •Молекулярныемеханизмыстероиднойрезистентностинарецепторномуровнеубольныхистиннойакантолитическойпузырчаткой
- •ИзучениеуровняэкспрессиимРнКα-иβ-изоформглюкокортикоидныхрецепторовустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольныхИап
- •Бетарецептор альфарецептор
- •3.2.2АнализклиническихданныхбольныхИаПприизменениинауровнеα-иβ-изоформглюкокортикоидныхрецепторов
- •3.2.3.Изучениеколичествамембранныхивнутриклеточныхрецепторовустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольных
- •10*3/Клетку
- •10*3/Клетку
- •3.2.4АнализклиническихданныхбольныхИаПприизменениимембранныхивнутриклеточныхрецепторов
- •МолекулярныемеханизмыстероиднойрезистентностинапострецепторномуровнеубольныхИап
- •ИзучениевключениямеченогоуридинавРнКлимфоцитовпериферическойкровиустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольныхИап
- •Количествовключенногоуридинав
- •Значимыйпоказатель
- •АнализклиническихданныхбольныхИаПприизменениивключения ³н-уридина
- •3.4.РазработкалечениябольныхИаПазатиоприномпристероиднойрезистентности
- •3.4.1Клиническиеданныеприпримененииазатиоприна
- •MaxдозаСгк
- •2 Раза
- •ДинамикакожныхвысыпанийубольныхИаПприлеченииазатиоприномвсочетаниисСгк
- •Осложнения,возникшиеустероидрезистентныхбольныхИаПприлеченииазатиоприномвсочетаниисСгк
- •ИзучениеэкспрессиигенаNf-kBустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольныхИаПиеединамикинафонетерапииазатиоприном
- •ЭкспрессиягенаNFkB относительногеновэкспрессииGapdhв% 90
- •Интервалзначений
- •ЭкспрессиягенаNFkB относительногеновэкспрессии
- •Интервалзначений
- •ЭкспрессиягенаNf-kBотносительно экспрессиигеновGapdhв% 90
- •АнализклиническихданныхстероидрезистентныхбольныхИап приизмененииэкспрессиигенаNf-kBнафонетерапииазатиоприном
- •Определениефакторанекрозаопухолиα(tnf-α)убольныхИап
- •Клиническиепримеры больныхИап
- •Патологоанатомический диагноз.Комбинированноеосновноезаболевание.
- •Проведены обследования:
- •60 Преднизолона
- •Преднизолон Метипред
- •Длительностьприемапрепарата
- •Былпроведенонкопоиск:
- •Заключительный клинический диагноз:
- •Глава4.Обсуждение полученных результатов
- •Практическиерекомендации
- •Библиография
Определениефакторанекрозаопухолиα (tnf-α)
ДляизучениясодержанияTNF-αиспользованатест-системыроссийскогопроизводителя(«Протеиновыйконтур»,СПб.,Россия).СутьметодикиопределенияTNF-αосновананатвердофазномиммуноферментноманализе.
Исследуемыйобразец(гомогенатклеток)вколичестве50мклвносилив50мклинкубационногобуфераивыдерживалиприкомнатнойтемпературе2часа.Затемудалялисодержимоеячеекипромывали4раза.Добавлялибиотинилированныйконъюгатвобъеме100мклиинкубировали2часаприкомнатнойтемпературе.Послечетырехкратногопромываниядобавляли100мклстрептавидиновогоконъюгатаиспустя30минут100мклхромогенного
раствора.После30-минутнойинкубациидобавляли100мклстоп-раствораисчитывалиоптическуюплотностьпри450нм.
Радиоизотопныйметод
Стандартнымметодомдоклиническогоизученияфармакологическойактивностиглюкокортикоидовпослужилрадиоизотопныйметод,спомощьюкоторогоможносравнить количествомРНКвклетке.
Постановкарадиоизотопногометода
ИнтенсивностьбиосинтезамРНКвлимфоцитахоценивалиповключению³Н-клетоквРНКклетокпоследующейметодике.К0,5мл
клеточнойсуспензии(15×10⁶кл/мл)лимфоцитовдобавляли20мклрастворагормона(конечнаяконцентрацияпреднизолонавпробах10⁻⁶М),послечего
клеткиинкубировалипритемпературе37Свтечение4часов.Вконтрольныхпробахклеткиинкубировалибезстероида.Через24часавкаждуюпробиркувносилипо2мкКи³Н-уридинавобъеме10мкл.(Удельнаярадиоактивность³Н-уридина5мкКи/ммольв1мл).Пробыинкубировалиеще1час,затемпробиркиохлаждалидо4Сицентрифугировали(3000g,10мин).Косадкудобавляли3мл5%растворапредварительноохлажденнойдо4Стрихлоруксуснойкислоты(ТХУ).Полученнуюсуспензиюцентрифугировали(3000g,10мин)идваждыотмывалив3млраствораТХУ(образующийсяврезультатематериал(осаждаемыйТХУ)состоитизпреципитированной³Н-уридин-РНК).Полученныйпослецентрифугированияосадокпереносиливофлаконыдляопределениясодержаниямеченогоуридинаметодомжидкостнойрадиометрии.
Жидкостнаясцинтилляционнаярадиометрия
Восновеметодалежитсвойствобета-частицвызыватьсцинтилляциювеществвспециальныхсредах.Этодаетвозможностьсбольшойэффективностьюрегистрироватьбета-излучение,обладающеемалойэнергией.
Длярегистрациирадиоактивностиобразецнафильтрепомещалив5млсцинтилляционнойжидкости.Еесостав:РРО(2,5-дифенилоксазол)-4г,
РОРОР(1,4-бис-2-метил-5-фенилоксазолилбензол)-0,4г,толуол-до1литра.СмесьтщательноперемешивалиирадиоактивностьобразцарегистрировалинажидкостномсцинтилляционномрадиометреPerkinElmerTri–Carb3110(ПроизводительСША).Эффективностьсчетадля³Нсоставляла50-55%.
Радиоактивностьизмеряливколичествераспадоввминуту(dpm),учитываяэффективностьсчетадляданногосчетчика,т.к.количествовспышек(cpm)будетменьшедлятакойрадиоактивнойметкикактритий.
Статистическаяобработкарезультатовисследования
Результатыисследованиябылиполученынакафедремолекулярнойфармакологииирадиобиологиироссийскогонаучно-исследовательскогомедицинскогоуниверситета им.Н.И. Пирогова.
Статистическийанализполученныхрезультатов,полученныхподвумгруппамбольныхпроводилиспомощьюпрограммыExcel;вычислялисредниезначенияпонесколькимизмерениям,погруппеСР(-)пациентовнаходилимедиануиинтервалзначений.
ДляопределениястатистическизначимыхотличиймеждугруппамибольныхиспользовалсяинтервалзначенийпоСР(-)пациентам.ПолученныерезультатыпогруппеСР(+)больных,которыеневходиливинтервалзначенийпроверялисьнастатистическуюзначимость(р<0,05)различиймеждугруппамиСР(+)иСР(-)пациентовспомощьюнепараметрическогокритерияМанна-Уитнидлянебольшойвыборки.