Діаліз;
Гель-проникаюча хроматографія в колонках;
Електрофорез;
МЕТОДИ ВИДІЛЕННЯ Й АНАЛІЗУ БІЛКА
ДІАЛІЗ
Використовують для виділення низькомолекулярних домішок або заміни складу середовища
ХРОМАТОГРАФІЯ
Гель-проникаюча хроматографія дозволяє розділяти білки за розміром і формою молекул. Поділ проводять у хроматографічних колонках заповнених сферичними частинками набухлого гелю із полімерних матеріалів. Білкові молекули, які не здатні проникати в гранули гелю, будуть переміщатися з високою швидкістю.
Середні та невеликі білки будуть утримуватися гранулами гелю
Електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності
додецилсульфату натрію
Метод базується на властивості заряджених часток (молекул) переміщатися під дією електричного поля
Електрофорез проводять у тонкому шарі поліакриламіду
МЕТОД ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ
Електрофорез.
Електрофорезом називається рух частинок в рідині під дією електричного поля.
На макромолекулу із сумарним зарядом Q в електричному полі напруженістю Е діє електрична сила Fе:
а – комплекс поліпептидного ланцюга (1) з молекулами ДСН (2);
б
– експериментально встановлено лінійний
зв'язок між електрофоретичною рухливістю
U
й логарифмом молекулярної маси М
(контрольні білки);
U=b-a·lgM
Кожна молекула ДСН має один негативний заряд, звідси загальна густина заряду приблизно однакова для різних білкових поліпептидних ланцюгів. Отже, поверхнева шуба з ДСН усуває зарядові відмінності нативних білків.
Після денатурації поліпептид має вигляд витягнутого циліндра довжиною 1,8 нм.
Відношення V до напруженості електричного поля Е називається електрофоретичною рухливістю U (м2· с-1·В-1):
П
ід
дією цієї сили відбувається прискорення
руху макромолекул, що створює опір у
в'язкому середовищі із силою тертя Fо
=fV,
де
V-
швидкість
руху макромолекул;
f-
коефіцієнт
внутрішнього тертя. Через певний період,
коли сили врівноважуються
(Fе=
Fо
), макромолекули
рухаються рівномірно з постійною
швидкістю
V:
де η – в'язкість середовища;
r – радіус макромолекули.
Найкращим методом, за яким визначається молекулярна маса й субодиничний склад макромолекул, є електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (ДСН).
Експериментально встановлено, що за певних умов електрофоретична рухомість залежить від молекулярної маси й на цю залежність не впливає загальний заряд макромолекули. До цього білок обробляють 1% розчином ДСН, яки є детергентом, що денатурує білки, крім чого додають β-меркаптоетанол для розриву дисульфідних зв'язків (1,4 кг ДСН на 1 кг білка).
Одночасно проводять електрофорез досліджуваного білка та маркерних білків з відомою молекулярною масою й графічно зображають цю залежність.
ІНШІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Метод радіаційної інактивації використовують для визначення розміру мішені, суть методу полягає у визначенні долі білкових молекул, які отримали пошкодження при опроміненні.
Електрофізіологічні методи;
Мікроскопія:
Заморожування-сколювання
(вугілля або Pt);
Електронна та електронна скануюча;
Флуоресцентна.
Також застосовують методи кругового дихроїзму, електронної мікроскопії, інфрачервону та раманівську спектроскопію, ЯМР.