9. Задание на самоподготовку.

9.1. Вопросы для повторения, необходимые для успешного усвоения данной темы (истоки знаний):

1. . Микроскопический метод исследования:

- цели, задачи, диагностические возможности;

- виды микроскопов, их назначение, разрешающая способность;

- ход лучей в световом и тёмнопольном микроскопах с иммерсионной системой и без неё;

- микрометрические приспособления и их назначение.

2. Морфология микроорганизмов:

- понятие, основные морфологические группы бактерий;

- методы изучения морфологии микроорганизмов.

3. Микроскопический анализ препаратов:

- способы подготовительной обработки предметных стёкол;

- приготовление мазков из агаровых и бульонных культур микроорганизмов, жидкого

(кровь) и вязкого (мокрота) материала;

- фиксация (назначение, методы);

- простая окраска;

- определение размеров бактерий.

4. Люминесцентный метод исследования:

- цели, задачи, возможности;

- оснащение метода.

9.2. Перечень контрольных вопросов:

№	Вопросы для самоподготовки	Целевые установки ответа на вопрос
1	Организация микробиологической лаборатории.	Необходимый набор помещений: а) приёмная для биологического материала б) комната для лабораторных анализов в) автоклавная: стерилизационно - убивочная г) лаборатория питательных сред (средоварка) е) боксы с бактерицидными лампами ж) моечная з) комната для обработки и стирки мягкого инвентаря (халатов, салфеток, масок и пр.) и) комната выдачи анализов к) комната персонала с раздевалкой
2.	Режим работы в бактериологической лаборатории.	Согласно приложения записать режим работы в лаборатории в протокол занятия.
3.	Микроскопический метод исследования.	Перечислить возможные модификации микроскопического метода исследований: - микроскопия с использованием светового микроскопа - микроскопия с иммерсионной системой - люминесцентная микроскопия - электронная микроскопия - сканирующая микроскопия.
4.	Морфология бактериальной клетки.	Описать морфологию прокариотов, назвать основные структурные элементы: постоянные и временные.
5.	Простые методы окраски бактерий.	Назвать принцип окраски простыми анилиновыми красителями.
6.	Сложные методы окраски бактерий.	Перечислить сложные дифференциальные методы окраски: - по методу Грама - по Ожешко - по Лефлеру - Бурри, Бурри-Гинсу
7.	Функциональные методы оценки подвижности.	Объяснить методы оценки подвижности бактерий: - метод «висячей капли» - метод «раздавленной капли»

Приложение 1

РЕЖИМ РАБОТЫ В БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

(Извлечение из санитарных правил СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами Ш-IУ групп патогенности и гельминтами» Минздрав России. М., 1999)

Работники бактериологической лаборатории должны постоянно помнить при работе с инфекционным материалом о возможности заразиться и перенести инфект за пределы лаборатории. Поэтому они должны быть особенно внимательны, опрятны и педантичны в работе.

В бактериологических лабораториях нужно соблюдать следующие правила и режим работы:

1. Находиться в помещении бактериологической лаборатории, а тем более работать обязательно в халате, шапочке (косынке), в отдельных случаях в маске и резиновых перчатках.

2. Без надобности переходить из одного помещения лаборатории в другое нельзя. При выходе из лаборатории халат и другую спецодежду следует снимать. Руки обязательно вымыть с мылом.

3. Особо опасные работы проводить в специальных боксах, облучаемых после их проведения бактерицидными лампами.

4. Для работы пользоваться только отведённым местом и оборудованием. Перекладывать заразный материал или предметы, соприкасающиеся с ним, на другое рабочее место (стул, подоконник и т.д.) запрещается.

5. Все лишние предметы не следует держать на рабочем месте. Сумки, тетради, книги должны быть спрятаны в стол или целлофановые мешки.

6. Категорически запрещается курить и принимать пищу в лаборатории.

7. После завершения работы в лаборатории рабочее место и руки дезинфицируются и моются с мылом.

МЕРОПРИЯТИЯ В СЛУЧАЕ АВАРИИ:

При аварии во время работы с инфекционным материалом (бой посуды, разбрызгивание из пипетки и т.д.) необходимо тщательно обеззараживать оборудование и инфицированные предметы. Для этого осуществляются следующие мероприятия:

а) применяют З - 5 % раствор хлорамина или фенола, который заливают в те места, куда попадает заражённый материал, а боковые поверхности мебели инвентаря, приборов, аппаратов и стены обмывают тампоном, смоченным тем же дез. раствором. Обработанные объекты оставляют на 30-40 минут, после чего производят обычную влажную уборку;

б) заразную одежду снимать и замачивать в 1 % растворе хлорамина; обувь обмывать тампоном, обильно пропитанным дез. раствором;

в) открытые участки кожи лица, рук и др. обрабатывать дез. раствором и 70 % этиловым спиртом. При загрязнении слизистых оболочек: рот полоскать либо 3 % раствором соды, либо 0,5 % раствором соляной кислоты или раствором марганцево-кислого калия 1:10000. Глаза промывают раствором борной кислоты и струёй воды, рот прополаскивают 0,05 % раствором марганцево-кислого калия или 0,1 % раствором борной кислоты.

Приложение 2

ОСНОВНЫЕ ВИДЫ МИКРОСКОПОВ

Микроскоп или оптическое устройство	Особенность и сущность	Разрешающая способность	Назначение
Световой микроскоп (МБИ - 1,2,3,6,11)	Все объекты рассматриваются в проходящем свете сухим и иммерсионным объективом	Разрешающая способность - 0,4-0,2 мкм. Увеличение при данной длине тубуса равно произведению увеличений объектива и окуляра. Минимальное - 6ЗО (для иммерсионного объектива) и максимальное -1350	Используется для изучения морфологии, структуры, подвижности и тинкториальных свойств микроорганизмов
Люминесцентный микроскоп	Использование ультрафиолетовых лучей и люминесцирующих красителей, способных светиться (флюоресцировать) под УФ - лучами. Позволяет наблюдать микроорганизмы в излучаемом ими свете и цвете	Разрешающая способность - 0.1 мкм. Повышение её связано с использованием коротковолновых ультрафиолетовых лучей. Максимальное увеличение - в 3000 раз. Преимущество- цветное изображение, высокая контрастность, возможность исследовать живые объекты.	Используется не только для изучения морфологии, и тинкториальных свойств, но и для исследования процессов жизнедеятельности микробной клетки.
Электронный микроскоп	Принцип действия и устройства подобен таковым у обычного светового микроскопа. Различия - вместо источника света – источник электроволн (вольфрамовая проволока, нагреваемая электротоком, вместо оптических линз - электромагнитные).	Разрешающая - способность 0.001 мкм. Первое промежуточное увеличение в 130 раз, от проекционной линзы - в 20 - 200 раз, в целом - 2500-25 000, максимум – в 100 000 раз.	Широко используется для изучения вирусов, мельчайших микроорганизмов. В бактериологии используется для изучения деталей тонкого строения.
Инвертированные микроскопы (тёмнопольный, фазово-контрастный)	Исследования проводят в проходящем свете в светлом или тёмном поле с применением метода фазового контраста. МБИ - 12,13 снабжены собственными столиками-термостатами, кинокамерами. Линзы окуляра и Объектива дают обратное увеличенное изображение.	Позволяет проводить широкий круг микроскопических исследований, визуальное наблюдение, фотографирование, применение светлого и тёмного полей в прямом и отражённом свете, прямое и косое освещение, микроскопирование в поляризованном свете, методом фазовых контрастов, в свете люминесценции.
Стереомикроскоп	Даёт подсвет в прямом и косопроходящем свете	Наиболее пригоден для крупных объектов (грибов)	Изучение колоний, микологических культур.

Приложение 3

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА К МИКРОСКОПУ

Бинокулярная насадка АУ - 12	Приближает микроскопию к условиям естественного зрения. Повышение трудоспособности работающего с микроскопом	Разрешающая способность несколько повышена	Применим к любому микроскопу
Микрометр - объект - окуляр	Объект-микрометр и окуляр-микрометр позволяют определить размеры бактерий с помощью расчётных сеток	Разрешающая способность несколько повышается, даёт возможность изучать микроорганизмы в нативном состоянии	Для изучения размеров
Темнопольный конденсор к световому микроскопу	Затемнение центральной части конденсора и, как следствие, боковое освещение объекта позволяет на тёмном фоне препарата видеть микроорганизмы в отражённом от них свете	Разрешающая способность повышается	То же, что и при темнопольной микроскопии
Фазово-контрастное устройство (объектив)	При обычной микроскопии в проходящем свете повышает контрастность и отражение за счет превращения фазовых смещений световой волны в амплитудные, улавливаемые глазом	В отличие от темнопольного устройства - даёт возможность наблюдать контрастные живые неокрашенные объекты на световом фоне	Используется для наблюдения за живыми биообъектами
Столик-термостат	Сохраняет подвижность объекта	Сохраняет жизнеспособность	При анализе простейших.

Приложение 4

ОБЕЗЖИРИВАНИЕ СТЁКОЛ производят одним из приведённых способов:

Назначение - хорошее прикрепление объекта.

а) Новые стёкла кипятят в 1 % растворе соды, затем промывают водой, слабым раствором соляной кислоты, вновь тщательно промывают водой.

б) Стёкла, бывшие в употреблении, сначала помещают в концентрированную серную кислоту или в смесь из 100 частей серной кислоты и 50 частей двухромовокислого калия и

1000 частей воды на 2 часа, после чего кипятят в щёлочи, тщательно промывают водой.

в) Погрузить стёкла в смесь 6 % хромовокислого калия и серной кислоты на 24 часа, после чего тщательно промывают водой. Хранят стёкла в 96 % растворе спирта.

г) Перед работой стёкла протереть мылом, прогреть на спиртовке, насухо вытереть марлей.

Приложение 5

ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ОКРАСКА МИКРОПРЕПАРАТОВ:

1. Подготовить для микроскопии 4 предметных стекла:

- обезжирить предметные стёкла, тщательно протерев их мылом и марлей;

- стёкла с помощью пинцета внести в пламя спиртовки, прогреть, охладить;

- тщательно протереть сухим ватным тампоном.

2. Приготовить 3 мазка из микробов, выросших на жидкой среде (обратить внимание на правильное положение рук: правой - держащей пробирку с ростом микробов в МПБ и левой - бактериальную петлю и ватную пробку);

- обжечь петлю в пламени спиртовки;

- охладить;

- открыть пробку пробирки левой рукой (мизинцем), обжечь её края над пламенем спиртовки;

- внести в МПБ петлю, взять 1 каплю культуры;

- обжечь края пробирки, пробку, закрыть пробирку, поставив её в штатив (не выпуская из правой руки петлю с материалом);

- обезжиренное, обожжённое в пламени спиртовки и охлаждённое предметное стекло взять большим и указательным пальцами в левую руку;

- петлёй материал нанести на стекло, равномерно растирая круговыми движениями по поверхности в виде круга;

- препарат высушить на воздухе и затем фиксировать методом фламбирования или прогрева, трижды внося в пламя спиртовки, охладить;

- пипеткой налить на мазок 3-4 капли красителя (метиленовый синий) на 3-4 мин.;

- промыть препарат водой, высушить на воздухе. Мазок готов для микроскопии:

3. Приготовить мазок из микробной культуры, выросшей на плотной среде - МПА:

- на обезжиренное стекло нанести каплю воды или физиологического раствора;

- с поверхности среды (обратить внимание на правильность положения пробирки с ростом скошенной поверхностью кверху), петлёй осторожно взять материал;

- обжечь края пробирки, пробку закрыть, поставить в штатив, не выпуская из рук петлю с культурой;

- внести материал петлёй в каплю воды на предметном стекле, равномерно растереть, на стекле с обратной стороны обозначить овалом или квадратом место нанесения материала;

- высушить на воздухе;

- фиксировать фламбированием, внося в пламя спиртовки трижды, охладить.

Приложение 6