Тема: Микробиологическая диагностика бактериальной дифтерии.
1. Место проведения: кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
2. Продолжительность: 90 мин (из них самостоятельная аудиторная работа 45 мин).
3. Цель занятия: ознакомление с биологией возбудителя дифтерии, основами патогенеза и клиники, методами ее микробиологической диагностики.
4. Мотивационная характеристика занятия: дифтерия относится к одной из немногих так называемых “управляемых” инфекций. В России, где имеются отечественные высокоэффективные препараты для профилактики дифтерии, соответствующие международным стандартам, заболеваемость этой инфекцией не должна превышать уровня спорадической, а летальность от дифтерии должна отсутствовать. Снижение заболеваемости дифтерией – одна из целей расширенной программы иммунизации ВОЗ. Одним из необходимых условий для достижения этих целей является совершенствование методов микробиологической диагностики, профилактики и эпиднадзора за дифтерийной инфекцией. Вышеперечисленное определяет необходимость изучения микробиологии дифтерии для правильного решения вопросов, связанных с ранней диагностикой, организацией мероприятий по профилактике этой инфекции.
5. В результате занятия:
Студент должен знать: таксономию, номенклатуру и биологию возбудителя дифтерии, основы патогенеза и основные клинические проявления заболевания, методы микробиологической диагностики, включая правила забора материала, его транспортировки и особенности бактериологического исследования.
Студент должен уметь: выбрать материал для исследования; оценивать результаты различных микробиологических методов диагностики.
Студент должен ознакомиться: с методическими рекомендациями и таблицами по теме, бак. препаратами.
6. Таблицы по данной теме:
Морфология C. diphtheriae.
Дифференциация коринебактерий.
Бактериологическое исследование материала при подозрении на дифтерию.
Учебные элементы:
Таксономические положения и биологические свойства возбудителей дифтерии.
Основы патогенеза и клиники дифтерии.
Методы микробиологической диагностики дифтерии.
7. Контрольные вопросы для подготовки к занятию:
1. Таксономическое положение и биология возбудителя дифтерии.
2. В чем особенности бактериологического исследования материала при подозрении на дифтерию?
3. Каковы источники и пути распространения дифтерии?
4. Патогенез и клиника дифтерии.
5. Чем осуществляется специфическая терапия и профилактика дифтерии?
6. На основании чего отбирается контингент на ревакцинацию против дифтерии?
7. Дифтерийный экзотоксин: местное и общее действие. Методы определения токсигенности C. diphtheriae.
8. Дифтерийный анатоксин. Получение, единицы измерения активности, практическое применение.
9. Дифтерийная антитоксическая сыворотка. Получение, единицы измерения активности, практическое применение.
10. ПЦР для диагностики дифтерии.
8. Содержание самостоятельной работы:
Виды самостоятельной работы:
Выполнение тестового задания и решение ситуационных задач по теме.
Решение задачи - задания с оформлением протокола бактериологического исследования мазка из зева больного при подозрении на дифтерию зева.
Ознакомление с направлением и материалом на бактериологическое исследование.
Изучить посевы отделяемого из зева на кровяно-теллуритовом агаре, отобрать и описать характерные изолированные колонии.
Провести иммерсионную микроскопию готовых мазков из подозрительных колоний, окрашенных по Граму и по Нейссеру.
Учесть биохимические свойства выделенной культуры.
Учесть пробу на токсигенность выделенной культуры.
Оценить результаты РПГА с сыворотками обследуемых и эритроцитарным анатоксическим дифтерийным диагностикумом для определения напряженности антитоксического иммунитета.
Алгоритм целевой деятельности студентов по выполнению заданий.
Наиболее частой локализацией процесса при дифтерии является поражение зева и носа.
Успех бактериологического исследования зависит от своевременного и правильного взятия материала. От больных с ангинами и с подозрением на дифтерию забор материала необходимо проводить в течение 3-4 часов с момента обращения в ЛПУ до начала какой-либо терапии.
Материалом служат слизь и пленки с миндалин из зева и носа. Взятие материала должны производить специально обученные медицинские работники.
Материал забирают стерильными ватными сухими тампонами отдельно для зева и носа. Материал из зева забирают натощак или не ранее, чем через 2 часа после еды; при хорошем освещении с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка, слизистых щек и зубов. При наличии налетов материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют один тампон, который вводят сначала в один, а потом в другой носовой ход, не касаясь крыльев носа снаружи.
Посев производят на чашку с кровяно-теллуритовым агаром (КТА). При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2х1 см2, а затем этим же тампоном, не меняя положения, производят посев отрывными линиями. Чашки инкубируют при температуре 37°С 24-48 ч. Посев следует производить на чашки с КТА, согретые при комнатной температуре или в термостате в течение 15-20 мин.
На КТА C. diphtheriae v. gravis образуют серовато-черные колонии диаметром 2-3 мм, плоские, с радиальной исчерченностью (R-форма); C. diphtheriae v. mitis — черные, матовые, диаметром 1-2 мм, выпуклые, с ровными краями (S-форма). В препаратах коринебактерии дифтерии - это грамположительные полиморфные, прямые и слегка изогнутые палочки, расположенные под углом или в виде растопыренных пальцев, а также образуют скопления, напоминающие войлок. При окраске по Нейссеру выявляются темно-синие зерна волютина, расположенные на концах клеток. Дифтероиды, в основном, располагаются «частоколом» и лишены зерен волютина.
Характерные колонии отсевают на скошенный сывороточный агар, ставят пробу Пизу и пробу на токсигенность. Дифтерию вызывают C. diphtheriae tax+.
Для определения токсигенности коринебактерий дифтерии можно использовать реакцию преципитации в агаре или ИФА.
Изучают характер роста культуры на скошенном сывороточном агаре и ставят биохимические тесты для дифференциации C. diphtheriae от других представителей рода и для определения биовара. C. diphtheriae ферментируют мальтозу, глюкозу с образованием кислоты без газа и не ферментируют сахарозу, не обладают уреазной активностью, проба Пизу (на наличие цистиназы) положительная.
Выделенную чистую культуру засевают на среды Гисса с глюкозой, сахарозой, крахмалом, цистином (проба Пизу) и мочевиной, а также повторяют пробу на токсигенность.
Оценивают результаты изучения биохимических свойств, пробы на токсигенность, устанавливают вид возбудителя, его биовар, наличие токсина и заполняют протокол бактериологического исследования.
Биовар определяют по характеру роста на бульоне (пленка, помутнение, крошковидный или крупнозернистый осадок); наличие гемолиза на кровяном агаре, характеру колоний на кровяно-теллуритовом агаре и способности к ферментации крахмала.
Определение уровня антитоксического иммунитета осуществляется для оценки эффективности и качества проведения прививочной работы и отбора контингента, подлежащего ревакцинации. С этой целью обследуется индикаторная группа населения, включающая лиц, имеющих документально подтвержденный прививочный анамнез и получивших последнюю прививку за 6-18 мес. до обследования. Для этой цели ставится РПГА в полистироловых планшетах.
Учет результатов РПГА осуществляется визуально и оценивается в крестах по степени агглютинации эритроцитов. В контролях должен отсутствовать феномен гемагглютинации. Титром сыворотки является последнее разведение, дающее реакцию гемагглютинации не менее ++. Защитный титр, равен 1:20.
Для микробиологической диагностики используют ПЦР и иммуноиндикацию.