Лабораторная работа №7. Получение дезоксирибонуклеопротеида (дрнп).
Реактивы и оборудование: говяжья селезенка, 2 М раствор NaCl, 1 М раствор NaCl, 0,4% раствор NaOH, раствор дифениламина (1г дифениламина, 2,75 мл H2SO4 конц., 100 мл ледяной уксусной кислоты), фуксинсернистая кислота конц.; фарфоровые ступки с пестиками, кварцевый песок, центрифуга, водяная баня, деревянные лучинки, пипетки, пробирки.
Ход работы: Помещают в ступку 2 г селезенки и добавляют немного кварцевого песка. Растирают до однородной массы и добавляют 5 мл 2М раствора NaCl, после чего растирают еще 3 минуты. Втечении 15 минут (порционно по 3-4 мл) добавляют 25 мл 1М раствора NaCl. Полученную смесь центрифугируют при 8000 об/мин 15 минут. Образовавшийся супернатант переливают в мерный цилиндр и замеряют объем. В стакан на 500 мл наливают воду из расчета на 1 мл супернатанта 10 мл воды, а затем при постоянном медленном перемешивании деревянной палочкой вливают в стакан супернатант. В растворе должны образоваться длинные белые нити – это и есть ДРНП. Нити из раствора переносят в две пробирки.
Качественные реакции с ДРНП.
Реакция с дифениламином на дезоксирибозу.
В первую пробирку вносят 1 мл 0,4% раствора гидроксида натрия и 2 мл раствора дифениламина. Раствор ставят на кипящую водяную баню на несколько минут до появления синего окрашивания.
Реакция с фуксинсернистой кислотой на свободную альдегидную группу.
Во вторую пробирку добавляют 1 мл концентрированной фуксинсернистой кислоты. Появляется фиолетовое окрашивание.
В результате кислотного гидролиза происходит распад гликозидных связей с пуриновыми основаниями. Образуется апуриновая ДНК с открытой формой дезоксиребозы, содержащей свободную альдегидную группу:
Лабораторная работа №8. Выделение рибонуклеопротеидов (рнп).
Реактивы и оборудование: Пекарские прессованные дрожжи, диэтиловый эфир, 0,4% раствор гидроксида натрия, 10% уксусная кислота, орциновый реактив, раствор дифениламина, соляная кислота(конц.); фарфоровые ступки и пестики, центрифуга, pH-метр, водяная баня, кварцевый песок, пипетки, стаканы, пробирки.
Ход работы: В ступку помещают 10 грамм дрожжей и немного кварцевого песка. Добавляют смесь из 2 мл эфира и 2 мл воды и тщательно растирают. Порциями по 3-4 мл вливают 40 мл 0,4% раствора гидроксида натрия. Растирание продолжают в течении 15 минут. Затем полученную смесь центрифугируют 15 минут при 8000 об/мин. Образовавшийся супернатант сливают в стакан и к нему приливают порционно по 0,5 мл 5-6 мл 10% уксусной кислоты до слабокислой реакции среды (контроль по индикаторной бумагой). В растворе образуются нити и осадок РНП. Если осадка мало, его можно отделить центрифугированием.
Качественные реакции на рнп. Реакция с дифениламином на рибозу.
Как и ДРНП РНП реагирует с дифениламином, но при этом окрашивается в другой цвет.
Ход работы: Часть полученных нитей и осадка РНП помещают в пробирку и добавляют в нее 1 мл 0,4% раствора NaOH и 2 мл дифениламина. Раствор тщательно перемешивают и помещают на кипящую водяную баню на 10-15 минут. Развивается зеленое окрашивание.