Лабораторная работа №3. Количественное определение белка по биуретовой реакции.

Биуретовая реакция белков не отличается высокой чувствительностью. Поэтому она применяется в тех случаях, когда содержание белка в исследуемом образце достаточно велико (несколько миллиграммов на миллилитр).

Реактивы и оборудование: Гидроксид натрия 10%, не содержащий примеси карбонатов (готовится разведением 75%-ного раствора гидроксида натрия, в котором карбонаты нерастворимы, прокипяченной дистиллированной водой, свободной от CO₂); хлорид натрия 1%, сульфат меди, сегнетова соль, раствор яичного альбумина; фотоэлектроколориметр (ФЭК), пипетки, пробирки.

Ход работы: Готовят три стандартных раствора белка с концентрациями 1%; 0,5%; 0,25%. Для этого берут 1%-ный раствор альбумина и разбавляют его в 2 и 4 раза 1%-ным раствором NaCl. Концентрация исследуемого раствора должна находиться в границах между 0,25% и 1%.

Готовят биуретовый реактив, растворяя последовательно в мерной колбе на 250 мл 0,375 г CuSO₄ * 5H₂O и 1,5 г сегнетовой соли (KOOC-CHOH-CHOH-COONa * 4H₂O) в 150 мл воды. Приливают медленно при постоянном перемешивании 75 мл 10% раствора гидроксида натрия и доводят содержимое до 250 мл водой. Биуретовый реактив не подлежит длительному хранению в стеклянной посуде.

В три пробирки вносят по 1 мл стандартных растворов и по 8 мл биуретового реактива, в четвертую пробирку - 1 мл раствора с неизвестной концентрацией и 8 мл биуретового реактива. Пробирки оставляют на 30 мин при комнатной температуре, после чего фотометрируют при длине волны 540 нм против контроля (дистиллированная вода). По полученным результатам строят калибровочную кривую и находят по ней неизвестную концентрацию.

Лабораторная работа №4.

Фракционирование биополимеров методом энзим-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГе).

Существует несколько видов электрофореза, но основной принцип на котором основан этот метод один. Демонстрационный опыт.

Лабораторная работа №5.

СВОЙСТВА АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ.

/КФ 3.2.1.1. – α-амилаза (1,4-α-Д-глюкан-глюко-гидролаза )/

Приготовление разбавленной слюны.

Рот ополаскивают 2-3 раза водой для удаления остатков пищи. Отмеряют 50 мл дистиллированной воды и ополаскивают ей рот в течении 5 мин в несколько приемов. Собранную жидкость (примерно 50-60 мл) фильтруют и фильтрат используют для работы.

Приготовление раствора Люголя.

30 г иодида калия растворяют в 30 мл воды. К полученному раствору прибавляют 10 г иода. После полного растворения иода добавляют воду до 500 мл.

Действие активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.

Реактивы и оборудование: 1% раствор крахмала, 1% раствор NaCl, 1% раствор CuSO₄, разбавленная слюна, раствор Люголя; пробирки.

Ход работы: В три пробирки помещают по 2 мл 1% раствора крахмала. В первую добавляют 1 мл воды, во вторую – 1 мл 1% раствора NaCl, в третью – 1 мл 1% CuSO₄. Во все пробирки добавляют по 1 мл слюны и через каждые 5 мин берут из каждой пробирки пробы объемом 0,5 мл. К пробам приливают несколько капель раствора Люголя и по окраске судят о скорости гидролиза. Результаты заносят в таблицу. Делают вывод об активирующем и ингибирующем действии разных солей.

Написать уравнение реакции неполного разложения крахмала под действием амилазы.

Лабораторная работа №6.

Демонстрация абсолютной специфичности уреазы.

/КФ 3.5.1.5 – мочевина-аминогидролаза/

Получение ферментного препарата.

Арбузные семечки (8-10 шт.) очищают от кожуры и растирают в ступке с 25 мл воды. Полученную суспензию центрифугируют 15 минут при 8000 об/мин и надосадочную жидкость используют в опыте.

Демонстрация абсолютной специфичности уреазы.

Реактивы и оборудование: 1% раствор мочевины, 1% раствор тиомочевины, ферментный препарат уреазы; пробирки.

Ход работы: В две пробирки наливают по 5 мл раствора фермента. В первую добавляют 5 мл 1% раствора мочевины, во вторую 5 мл 1% раствора тиомочевины. В обе пробирки добавляют по 2-3 капли 0,02% спиртового раствора фенолфталеина. Содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 15-20 мин при комнатной температуре.

В пробирке с мочевиной происходит образование аммиака, в результате чего реакционная смесь подщелачивается и в присутствии индикатора окрашивается в малиновый цвет. Во второй пробирке раствор остается бесцветным, так как расщепление тиомочевины не происходит.