58

1.Перед посівом реплікатор занурюють у спирт, обпалюють, охолоджують і опускають у лунки з суспензіями дріжджів, потім переносять на контрольну чашку з мінімальним середовищем. Цей висів призначений для того, щоб ще раз переконатися, що відібрані мутанти не ростуть на мінімальному середовищі.

Реплікатор знову опускають у чашку з лунками й переносять на чашку з повним середовищем, щоб упевнитись, що мутантні культури нормально ростуть на повному середовищі.

2.Після контрольних висівів аналогічно проводять висів суспензії на 12 чашках з ростовими факторами. При цьому перед кожним введенням реплікатора

влунки необхідно його обпалювати для того, щоб на стрижнях не залишилося середовища з попереднього висіву.

Опрацювання результатів

Після завершення роботи чашки в переверненому стані поміщають у термостат з температурою 30 °С на сім діб. Після цього аналізують вирослі колонії і, порівнюючи отримані результати з даними табл. 5.1, визначають, які саме ростові речовини потрібні отриманим ауксотрофним мутантам. Ці результати заносять у табл. 5.2.

Контрольні запитання

1.Які організми називають ауксо- і прототрофами?

2.Що означає термін «біохімічний мутант»? Чим такий мутант відрізняється від мутантів звичайних?

3.Які існують методи селекції мутантів? Як здійснюється ідентифікація ауксотрофних мутантів?

4.Охарактеризуйте метод накопичення мутантних мікроорганізмів.

5.Що лежить в основі методу накопичення ауксотрофних мутантів?

6.Як використовують методи відбору й ідентифікації мікроорганізмів у практичних цілях?

Література: [1, 2, 5, 9].

59

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ 6 ФЛУКТУАЦІЙНИЙ ТЕСТ ЛУРІЯ Й ДЕЛЬБРЮКА

Мета: визначення титру життєздатних клітин у вихідній і незалежній культурах; аналіз і опрацювання результатів.

Обладнання та матеріали: термостат; пробірки з 4,5 та 10 мл фосфатного буфера; пробірки з 2 мл повного середовища; чашки Петрі з повним агаризованим середовищем; чашки Петрі з повним агаризованим середовищем зі стрептоміцином; шпателя; стерильні піпетки; культура E. coli К12 Hfr концентрацією близько 2·109 клітин/мл.

Загальні відомості

Для пояснення природи виникнення стійкості мікроорганізмів до різних негативних факторів навколишнього середовища (як і природи мінливості) довгий час використовували дві гіпотези:

•адаптаційну, коли всі клітини рівною мірою здатні набувати стійкість до селекційного фактора; кількість стійких клітин пропорційно числу клітин у популяції;

•мутаційну, яка припускає спонтанне виникнення стійких клітин у популяції, перш ніж вона буде піддана дії селективного агента; потомство клітини-мутанту утворить клон стійких особин.

С. Лурія вдалося розробити експериментальний метод, що дозволяє відрізнити стан індукованої резистентності від резистентності, що виникає внаслідок попередньої спонтанної мутації. Цей метод, що отримав назву «флуктуаційний тест», опис якого було опубліковано в 1943 році спільно з М. Дельбрюком, що розробив математичну модель процесу, став першим свідченням на користь мутації бактерій.

Флуктуаційний тест Лурія і Дельбрюка полягає в тому, що невеликі об’єми вихідної культури бактерій розсіюють в пробірки з рідким середовищем, а після декількох циклів поділу додають в пробірки антибіотик. Потім (без подальших поділів) на чашці Петрі з агаризованим середовищем висівають життєздатних стійких до антибіотика бактерій. Тест показав, що число стійких колоній з різних пробірок дуже мінливе – в більшості випадків воно невелике (або нульове), а в деяких випадках дуже високе. Це означає, що мутації, що викликали стійкість до антибіотика, виникали у випадкові моменти часу як до, так і після його впливу.

Для оцінки результатів флуктуаційного тесту визначають і порівнюють дисперсію σ2 кількості стійких клітин у пробах з незалежних культур і кількість стійких клітин проб з однієї культури.

Дисперсію – суму квадратів відхилень варіантів від середнього, віднесену до числа степенів вільності, визначають за формулою:

σ 2 = ∑(M −M )2 ,

n −1

де М – кількість стійких клітин в окремій пробі; M – середня кількість стійких клітин; n – число проб

60

Якщо дисперсія для проб із незалежних культур перевищує дисперсію для проб з однієї культури, це свідчить про мутаційну природу ознаки.

Тест є показовим для визначення стійкості різних видів бактерій до бактеріофага, лікарських речовин, радіації, здатності зброджувати деякі вуглеводи. Його використовують для визначення частоти спонтанних мутацій у культурах одноклітинних мікроорганізмів і культурах соматичних клітин тварин.

Темп спонтанної мутації або частота виникнення мутацій а визначається на клітину за одну генерацію. Величина а дорівнює відношенню середнього числа виявлених мутацій m до числа новоутворених клітин, які існували протягом

середнього часу в одній генерації N1 :

де N0, Nt – кількість клітин відповідно вихідна та кінцева;

Використовуючи тест Лурія–Дельбрюка, можна обчислити значення m за часткою проб, у яких не відбулося жодної мутації Р0 за такою формулою:

m = −ln P0 ,

тоді:

a = −(ln P0 )(ln 2).

Nt − N0

Під час тестування слід враховувати такі фактори:

•вихідне число клітин, що їх висівають у незалежні культури, має бути невелике (для E. coli 10–100 клітин). Це зменшує ймовірність потрапляння в пробу висіву раніше виниклих мутантних клітин;

•тривалість росту і об'єм незалежних культур також мають бути обмежені. Потрібно пам'ятати, що у разі використання надто численних популяцій незалежних культур розходження між ними нівелюються через нагромадження великої кількості розподілених у часі мутацій;

•всі культури слід висівати однаковою кількістю клітин й інкубувати в ідентичних умовах.

Завдання на виконання

1.Для виконання роботи використовують культуру E. coli К12 Hfr, вирощену на повному середовищі концентрацією близько 2·109 клітин/мл (рис. 6.1). Для її одержання бактеріальні клітини висівають за 16 – 18 год на повному середовищі, інкубують при температурі 37 °С з аерацією. Кожен студент отримує 2 мл вихідної культури.

2.Для одержання незалежних культур з вихідної суспензії готують сім десятикратних розведень суспензії у фосфатному буфері. З останнього розведення відбирають пробу 0,1 мл і вносять у пробірку з 2 мл повного середовища,