54

4. За отриманими даними побудувати графік залежності виживання клітин від дози мутагену та криву доза – ефект для частоти індукованих мутацій аденозинзалежності.

Контрольні запитання

1.Що таке мутаген та мутагенез?

2.Які вам відомі мутагенні фактори? Охарактеризуйте їх.

3.Охарактеризуйте мутації залежно від причин, що їх викликали.

4.Як підрозділяють мутації залежно від клітин, в яких відбулись зміни?

5.Охарактеризуйте мутації за результатами для організму.

6.Які ви знаєте мутації за змінами генетичного матеріалу?

7.Що таке «мовчазні мутації»?

8.Охарактеризуйте зворотні мутації та реверсії.

9.Що таке індукований мутагенез? Які його механізми?

10.Яка роль мутагенів у природі й експерименті?

11.Які мутагенні фактори викликають зміни в геномі клітини? 12.Як оцінити дію мутагену?

13.На чому ґрунтується статистичне опрацювання результатів дії мутагенів? Які основні розрахунки?

Література: [1, 2, 3, 7, 8, 11].

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ 5 ВІДБІР ТА ІДЕНТИФІКАЦІЯ БІОХІМІЧНИХ МУТАНТІВ

Мета: одержання відбитків методом реплік для відбору ауксотрофних мутантів; опанування методів ідентифікаціЇ ауксотрофних мутантів.

Обладнання та матеріали термостат; чашки Петрі з мінімальним та повним середовищами; оксамит; чашки з м'ясо-пептонним агаром, мінімальним середовищем з ростовими добавками; чашка з лунками; репліка тор; стерильні піпетки; пробірки зі стерильною дистильованою водою.

Загальні відомості

Більшість мікроорганізмів самі синтезують всі необхідні їм амінокислоти (наприклад, E. сoli). Але деякі мікроорганізми не мають такої здатності і потребують готових амінокислот, які вносять у поживне середовище. Це так звані ауксотрофи. Отже, організми, які потребують факторів росту, називаються ауксотрофами, а організми, яким т акі фактори росту не потрібні – прототрофами. Мікроорганізми можуть бути ауксотрофами не тільки за амінокислотами, а також за вітамінами, нуклеотидами та ін.

Кількість і природа факторів росту різні для різних мікроорганізмів. Для росту молочнокислих бактерій потрібні практично всі амінокислоти, пурини та піримідини, вітаміни. Багатьом мікроорганізмам потрібні вітаміни. Так, Clostridium kluyveri росте на середовищі з біотином і параамінобензойною кислотою.

У генетиці, штам називається ауксотрофним, якщо він несе мутацію, яка робить його нездатним до синтезу однієї або декількох важливих сполук.

55

Наприклад, клітини дріжджів, в яких інактивований ген в ланцюжку синтезу урацила – урациловий ауксотроф. Ауксотрофи часто використовують у якості генетичних маркерів.

Вплив мутагенного агента на клітину призводить до зміни біохімічних процесів в організмі. Проте термін «біохімічні, або ауксотрофні мутанти» найчастіше використовують у вужчому значенні для позначення мутантів зі зміненими потребами до певних факторів росту. Такі мутанти часто використовують у біохімічних дослідженнях для встановлення шляхів біосинтезу в клітині різних сполук, а також у селекції мікроорганізмів – продуцентів таких біологічно активних речовин, як амінокислоти, антибіотики, вітаміни тощо.

Для біохімічних мутантів характерні порушення здатності до синтезу якогонебудь компонента внутрішньоклітинного обміну, у результаті чого припиняється ріст мутанта на середовищі, що не містить цього компонента (ауксотрофи). Дикі форми мікроорганізмів, що виникають у таких випадках, є прототрофами. У разі багатокомпонентної залежності розрізняють поліауксотрофність.

Існує ряд методів, що дають змогу селекціонувати мутанти за певними ознаками. До них належать метод тотального відбору на повному середовищі; метод реплік або відбитків; метод уповільненого збагачення середовища (тришарове заливання чашок середовищем різного поживного складу) і ін.

На звичайних агаризованих середовищах лише деякі мутації можна виявити безпосередньо за зміною пігменту, зміною росту колоній та іншими ознаками. Деякі ознаки виявляються, якщо добавити у середовище індикатори чи барвники. Для виділення ауксотрофних мутантів (наприклад ауксотрофних за амінокислотою гістидином) порівнюють ріст клітин на двох середовищах: з гістидином і без нього. Мутанти будуть рости тільки на середовищі з гістидином.

Як правило, частота виникнення мутацій невисока. Тому для виявлення та відбору мутантів використовують методи накопичення мутантів. Отримати накопичувальну культуру мутантів, стійких до антибіотиків, отруйних речовин і фагів досить легко: на середовищі, до якого добавлений відповідний агент, будуть рости тільки мутантні штами. Методи накопичення ауксотрофних мутантів ґрунтуються на зворотному принципі: для клітинної суспензії створюють умови, в яких мутанти не ростуть, а прототрофні клітини відсіваються або знищуються.

Ідентифікація ауксотрофних мутантів. Розроблено численні методи ідентифікації (визначення специфічних потреб) ауксотрофних мутантів, так звані методи ауксонографії, що ґрунтуються на використанні мінімального середовища з добавками певних ростових речовин. Ростові потреби ауксотрофних мутантів можуть забезпечуватися такими фізіологічно важливими речовинами, як амінокислоти, азотисті основи, вітаміни. Концентрації їх у середовищах становлять відповідно 1 – 10 мкг/мл. Розроблені методики постановки досліджень на виявлення відношення мікроорганізмів до кожної із груп ростових речовин.

До числа найефективніших належить метод Холідея (1956 р.), що дає можливість визначити потреби досліджуваних мутантів в 36 ростових факторах, використовуючи лише 12 чашок із мінімальним середовищем збагаченого ростовими факторами в такий спосіб: по 6 ростових факторів на чашку у сполученнях, представлених у табл. 5.1.