Введение в биотехнологию.

Биотехнология – методы и приемы получения полезных для человека продуктов и явлений с помощью живых организмов (бактерий, дрожжей и др.) Биотехнология открывает новые возможности для селекции.

Современная биотехнология характеризуется использованием биологических методов для борьбы с загрязнением окружающей среды (биологическая очистка сточных вод), защита растений от вредителей и болезней, производства ценных биологически активных веществ (антибиотиков, ферментов, гормональных препаратов) для народного хозяйства. На основе микробиологического синтеза разработаны промышленные методы получения белков, аминокислот, используемых в качестве кормовых добавок. Развитие генной и клеточной инженерии позволяет целенаправленно получать ранее недоступные препараты (например, инсулин, интерферон, гормон роста человека и др.) , создавать новые полезные виды микроорганизмов, сорта растений , пород животных. К достижениям новейшей биотехнологии можно отнести также применение иммобилизованных ферментов, получение синтетических вакцин, использование клеточной технологии в племенном деле на животноводческих комплексах и др.

Широкое распространение получили гибридомы и продуцируемые ими моноклональные (одной специфичности) антитела, используемые в качестве уникальных реагентов, диагностических и лечебных препаратов.

Биотехнологические методы направлены на получение микробной биомассы хлебопекарных дрожжей , дрожжей из мелассы, дрожжей на этанольной среде, кормовых дрожжей, кормовой биомассы из целлюлозосодержащих субстратов, микробной биомассы из природного газа, биомассы водородных бактерий, медицинских дрожжей, заквасок молочнокислых бактерий, а также на производство вакцин, бактериальных удобрений, бактериальных средств защиты растений.

С помощью клеток микроорганизмов в промышленности получают липиды, полисахариды, этиловый спирт, органические растворители, органические кислоты (уксусную кислоту и уксус, молочную кислоту, пропиленовую, лимонную, глюконовую, фумаровую и другие кислоты), витамины (группы В, D, каротиноиды), антибиотики (пенициллин, кормовой биомицин), ферментные препараты.

Микроорганизмы используют для трансформации органических соединений , защита окружающей среды, в том числе очистки сточных вод и микробиологической переработки навоза и пр. Современная биотехнология использует достижения биохимии, микробиологии, молекулярной биологии и генетики.

Микробиологический синтез

Микробиологический синтез - синтез структурных элементов или продуктов обмена веществ микроорганизмов за счёт присущих микробной клетке ферментных систем. При микробиологическом синтезе, как и любом органическом синтезе, сложные вещества образуются из более простых соединений. Микробиологический синтез следует отличать от брожения, в результате которого тоже получаются различные продукты микробного обмена (например, спирты, органические кислоты), но преимущественно за счёт распада органического вещества. Значительная часть продуктов, образующихся в ходе микробиологического синтеза обладает физиологической активностью и представляет практическую ценность для народного хозяйства.

         К микробиологическому синтезу относят широкий круг процессов.

1. Накопление микробной массы для использования её: а) в качестве белково-витаминных добавок к кормам; б) как источника получения белков, липидов, ферментов, токсинов , витаминов, антибиотиков; в) для борьбы с паразитами животных и растений; г) в качестве носителя ферментативной активности в реакциях микробиологической (энзиматической) трансформации органических соединений.

2. Получение накапливающихся вне микробной клетки метаболитов, в том числе ферментов, токсинов, антибиотиков, аминокислот, витаминов, нуклеотидов и т.п.

      Микробиологический синтез осуществляется внутри клетки при активации низкомолекулярных компонентов (например, коферментом А и участии нуклеотид фосфатов, чаще всего адениловых производных). Затем многие метаболиты выводятся из клетки в среду. Характерная особенность микроорганизмов — их способность к сверхсинтезу, т. е. избыточному образованию некоторых продуктов обмена веществ (многих аминокислот, нуклеотидов, витаминов), превышающему потребность микробной клетки. Так, глутаминовая кислота при сверхсинтезе может накапливаться в количестве свыше 10 мг/мл среды (культура Micrococcus glutamicus), витамин B₂ — до 1—2 мг/мл (грибы Eremothecium ashbyii u Ashbya gossipii), вместо обычных сотых и даже тысячных долей мг. Способность к сверхсинтезу того или иного соединения свойственна определённым видам микроорганизмов, которыми, как правило, и пользуются в качестве продуцентов при производстве соответстветствующих метаболитов путём микробиологического синтеза. При этом применяют не только культуры, отобранные из природных источников, но и специально выведенные искусственным путём Мутанты — штаммы, у которых сверхсинтез — следствие нарушений обмена веществ под воздействием мутагенов. Применение мутантов позволяет значительно увеличить выход ряда продуктов. Например, выведены культуры с высоким уровнем сверхсинтеза лизина, инозиновой кислоты, некоторых витаминов. При помощи мутантов удалось в 100—150 раз поднять активность биосинтеза пенициллина; мутантные штаммы используются при производстве как этого, так и др. антибиотиков.

         В процессе микробиологического синтеза получают ряд продуктов, причём за счёт самых разных соединений углерода и азота. Это обусловливается большим разнообразием ферментных систем микроорганизмов. Так, для синтеза белков, нуклеиновых кислот и др. метаболитов клетки могут использовать в зависимости от особенностей культуры разные неорганические источники азота, а из соединений углерода — различные углеводы, органические кислоты (в т. ч. уксусную кислоту), жидкие, твёрдые или газообразные углеводороды и др. Определённые виды, способные к Хемосинтезу или Фотосинтезу, в качестве источника углерода могут усваивать углекислый газ. Таким образом, подбор соответствующих культур даёт возможность получать путём микробиологического синтеза, желаемые вещества из дешёвого и доступного сырья. Эти особенности делают микробиологический синтез весьма эффективным способом производства многих соединений; часть из них (например, многие антибиотики) экономически выгодно получать ныне только таким путём.

         Некоторые продукты микробиологического синтеза давно использовались человеком (например, пекарские дрожжи), но широкое промышленное применение микробиологического синтеза получил начиная с 40—50-х гг. 20 в. Прогресс в этой области связан прежде всего с открытием пенициллина, что побудило начать детальные исследования у микроорганизмов продуктов обмена веществ, обладающих физиологической активностью. Освоение в промышленных масштабах производства пенициллина привело к решению многих микробиологических, технологических и инженерных задач. Это, наряду с расширением производства дрожжей как белково-витаминных добавок к кормам, послужило основой для развития промышленного микробиологического синтеза. Так, в частности, были созданы специальные аппараты — ферментёры, с помощью которых можно вести технологический процесс биосинтеза без доступа посторонних микроорганизмов, снабжённые устройствами для перемешивания среды и для подачи стерильного воздуха.

         Технологически современный процесс микробиологического синтеза состоит из ряда последовательных этапов (операций). Главные из них: подготовка необходимой культуры микроорганизма-продуцента; подготовка питательной среды; выращивание посевного материала; культивирование продуцента в заданных условиях, в ходе которого и осуществляется микробиологический синтез, часто называемый ферментацией (например, ферментация антибиотиков); фильтрация и отделение биомассы; выделение и очистка требуемого продукта, когда это необходимо; сушка. Процессы выделения и очистки, часто занимающие важное место среди др. технологических операций, определяются химической природой получаемого вещества и могут включать экстракционные и хроматографические методы, кристаллизацию, осаждение и др. Наиболее прогрессивным способом культивирования считается непрерывный — с непрерывными подачей питательной среды и выводом продуктов микробиологического синтеза. Так производят, например, микробную биомассу (кормовые дрожжи). Однако непрерывный способ разработан далеко ещё не для всех процессов микробиологического синтеза, и большинство метаболитов (аминокислоты, антибиотики, витамины) получают периодическим способом — с выводом продукта в конце процесса. В некоторых случаях (например, при производстве ряда ферментов) продуценты выращивают не в ферментёрах с аэрацией и перемешиванием (глубинный способ), а на поверхности питательной среды — т. н. поверхностным способом. Для производства разнообразных продуктов микробиологического синтеза. в СССР создана Микробиологическая промышленность, уже выпускающая большой ассортимент соединений разных классов. Работы в области М. с. проводятся почти во всех промышленно развитых странах. Во многих из них продукты М. с. являются важной составляющей экономики страны, например производство ферментов и аминокислот — в Японии, лекарственных препаратов — в Венгрии.

         Антибиотики — один из первых продуктов микробиологического синтеза, которые широко производят для медицины и сельского хозяйства. Большинство антибиотиков накапливается вне клеток микроорганизма-продуцента, которыми в основном являются Актиномицеты, некоторые грибы и бактерии, главным образом их мутантные формы. Антибиотические препараты, употребляемые преимущественно в медицине, отличаются высокой степенью чистоты. На корм животным чаще идёт концентрат среды после выращивания в ней продуцента, иногда вместе с биомассой, содержащий значительное количество др. продуктов обмена веществ продуцента, в том числе витамины, аминокислоты, нуклеотиды и т.п. Некоторые антибиотики (фитобактериомицин, трихотецин, полимиксин) используются как средства защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов.

         Витамины, провитамины, коферменты. Методом микробиологического синтеза производят в основном витамин B₁₂, а частично и витамин B₂ и его коферментную форму — флавинадениндинуклеотид (ФАД), каротиноиды, эргостерин. Кроме того, развивается производство разных др. соединений этого типа (никотинамидные коферменты и др.). Витамин B₁₂ получают практически только путём микробиологического синтеза. Основными продуцентами при этом служат пропионовокислые бактерии, актиномицеты, а также комплекс метанобразующих бактерий, использующих отходы бродильной промышленности (послеспиртовые, ацетоно-бутиловые барды и др.) и применяемых в основном для получения кормового концентрата (высушенная среда с биомассой продуцента). Многие микроорганизмы способны к сверхсинтезу витамина B₂ с активным выделением его в среду, но в качестве промышленных продуцентов употребляют наиболее активные культуры, главным образом грибы Eremothecium ashbyii и Ashbya gossipii. Помимо свободного витамина, при помощи Е. ashbyii получают также ФАД. β-каротин — провитамин витамина А, получаемый также др. способами (извлечение из моркови и др. объектов, химический синтез), образуется наряду с др. каротиноидами (См. Каротиноиды) мн. микроорганизмами и содержится в клетках, придавая биомассе характерную окраску от жёлтой до красных тонов; однако наибольший практический интерес представляет культура Blakeslea trispora — самый активный синтетик, которым и пользуются в основном в качестве продуцента при промышленном биосинтезе. Эргостерин — провитамин витамина D₂ — содержится в клетках многих дрожжей; основным источником его промышленного получения служат пекарские дрожжи. Однако уже имеются дрожжевые культуры со значительно более высоким уровнем накопления эргостерина. Комплекс витаминов и коферментов синтезируется, кроме того, в процессе развития дрожжей и накапливается в дрожжевой биомассе, которая привлекает всё более пристальное внимание как источник этих соединений.

         Ферменты, синтезируемые микроорганизмами, и создаваемые на их основе ферментные препараты приобрели большое значение в народном хозяйстве, особенно в пищевой промышленности. Продуцентами ферментов — протеаз, амилаз, фосфатаз, целлюлаз, пектиназ, глюкозооксидазы, липаз, каталазы — служат многие мицелиальные грибы, некоторые актиномицеты и бактерии. В зависимости от локализации фермента подвергают обработке микробную массу или фильтрат, свободный от микробных клеток. Получение чистых ферментных препаратов связано со значительными технологическими трудностями. Такие препараты обычно очень дороги; поэтому в промышленности используют комплексные препараты, содержащие, например, протеазы и липазы, протеазы и амилазы.

         Аминокислоты. Наблюдаемый во многих странах недостаток ряда аминокислот в рационах человека и кормах животных вызвал промышленное их получение, в том числе и методом микробиологического синтеза. Существенное преимущество микробиологического синтеза аминокислот перед химическим методом заключается в получении их непосредственно в виде природных изомеров (L-формы). Из аминокислот, вырабатываемых микробиологическим синтезом, наиболее важны Лизин и Глутаминовая кислота. Продуцентами аминокислот обычно служат культуры бактерий, относящихся к родам Brevibacterium и Micrococcus; для производства используются преимущественно мутанты-ауксотрофы, осуществляющие сверхсинтез соответствующей аминокислоты с выделением её в среду.

         Нуклеотиды. Широкое развитие микробиологического синтеза нуклеотидов, в частности инозиновой, гуаниловой и др. кислот, получил в Японии, где они используются главным образом как добавки к специфическим продуктам восточной кухни. В будущем нуклеотиды приобретут, вероятно, более важное значение в качестве регуляторов многих энзиматических и гормональных процессов в животном организме. Накопление нуклеотидов происходит преимущественно в культуральной жидкости, т. е. вне клеток продуцентов. Для микробиологического синтеза нуклеотидов, как и аминокислот, используются биохимические мутанты с выраженным сверхсинтезом нужного соединения.

         Белок и белково-витаминные препараты. Особое значение как источник белка имеет микробная биомасса. Производство такой биомассы на дешёвом сырье рассматривают как одно из средств устранения растущего белкового дефицита в питании человека и животных. Наиболее интенсивное развитие получили промышленные методы микробиологического синтеза так называемых кормовых дрожжей, применяемых в виде сухой биомассы как источник белка и витаминов в животноводстве. Кормовые дрожжи содержат значительном количество белка (до 50—55%), в состав которого входят незаменимые аминокислоты, например лизин, Триптофан, Метионин; они богаты витаминами, многими микроэлементами. Для выращивания кормовых дрожжей использовали преимущественно дешёвое углеводное сырьё — гидролизаты отходов деревообрабатывающей промышленности, непищевых растительных материалов (подсолнечная лузга, стержни кукурузных початков и т.п.), сульфитные щелока, различные виды барды и т.д. Ныне в крупных промышленных масштабах организуется производство дрожжей на углеводородах (н-алканах, газойле, различных фракциях нефти). Большие запасы этого сырья позволяют планировать крупнотоннажное производство микробной биомассы. Для получения белково-витаминной биомассы изучается также возможность применения бактерий. Многие бактерии хорошо растут на углеводородах, в частности газообразных (например, на метане), а также на др. источниках углерода (например, на метаноле и уксусной кислоте). Углеводороды и их производные привлекают внимание и как сырьё для микробиологического синтеза отдельных физиологически активных соединений (аминокислот, витаминов, нуклеотидов и т.д.).

         К числу продуктов микробиологического синтеза следует отнести и некоторые средства защиты растений: бактериальные энтомопатогенные препараты (например, энтобактерин, инсектин, дендробациллин), вызывающие гибель вредных насекомых и предотвращающие их массовое размножение. Указанное действие вызывают своеобразные «белковые кристаллы» — носители токсичности, расположенные в микробных клетках.

         Методом микробиологического синтеза получают также многие Бактериальные удобрения.

         К частному случаю микробиологического синтеза относится микробиологическая трансформация органических соединений. За счёт высокой активности специфических энзиматических систем микроорганизмы оказываются способными осуществлять ряд реакций на молекуле органического соединения, не меняя его основной структуры. Наиболее изучены реакции на молекулах стероидных соединений. В строго определённых положениях осуществляются реакции дегидрирования, дезацетилирования и гидроксилирования, в результате чего меняется физиологическая активность исходного стероидного соединения. Благодаря подбору соответствующих микроорганизмов — носителей специфических ферментных систем — метод микробиологической трансформации получает всё большее распространение.

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия – выращивание клеток вне организма на специальных питательных средах, где они растут и размножаются, образуя культуру ткани. Это метод конструирования клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции. Клеточная реконструкция связана с созданием жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток (ядра, цитоплазмы, хромосом и др.). С помощью клеточной инженерии удается соединять геномы весьма далеких видов. Показана принципиальная возможность слияния соматических клеток животных с клетками растений. Изучение гибридных клеток позволяет решать многие теоретические проблемы биологии и медицины: выяснить взаимные влияния ядра и цитоплазмы; механизмы клеточной дифференцировки и регуляции клеточного размножения, превращения нормальной клеток в раковую и т.д.

При гибридизации искусственно объединяют целые клетки (протопласты клеток) с образованием гибридного генома. С помощью ферментов или ультразвука удаляют клеточные стенки растительных клеток и соединяют «голые» протопласты клеток. После этого клеточные стенки восстанавливаются, и образуют каллус – неорганизованная клеточная масса, вызывая дифференциацию клеток которой получают целое гибридное растение.

Клеточная инженерия широко применяется в биотехнологии, например, использование гибридов (гибридных клеток) для получения моноклональных антител. На основе генетически измененных клеток возможно создание новых форм растений, обладающих полезными признаками и устойчивых к благоприятным условиям среды и болезням.

Генная инженерия

Генная инженерия – искусственная перестройка генома. Раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием in vito (в пробирке) новых комбинаций генетического материала, способного размножаться в клетке-хозяине и синтезировать продукты обмена веществ. Сопровождаться искусственным переносом нужных генов от одного вида живых организмов (бактерий, растений, животных) к другому, зачастую далекому по происхождению. Современные генные технологии используют для генотерапии, т.е. лечения наследственных болезней путем введения человеку «здоровых» генов.

Высшим достижением современной биотехнологии является генетическая трансформация, перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками. По своим целям и возможностям в перспективе это направление является стратегическим. Оно позволяет решать коренные задачи селекции биологических объектов на устойчивость, высокую продуктивность и качество продукции при оздоровлении экологической обстановки во всех видах производств. Однако для достижения этих целей предстоит преодолеть огромные трудности в повышении эффективности генетической трансформации и прежде всего в идентификации генов, создании их банков клонирования, расшифровке механизмов полигенной детерминации признаков и свойств биологических объектов, обеспечении высокой экспрессии генов и создании надежных векторных систем. Уже сегодня во многих лабораториях мира, в том числе и в России, с помощью методов генетической инженерии созданы принципиально новые трансгенные растения, животные и микроорганизмы, получившие коммерческое признание.

Современная биотехнология

Современная биотехнология тесно стыкуется с рядом научных дисциплин, осуществляя их практическое применение или же являясь их основным инструментом (рис. 1).

Рис. 1. Связь биотехнологии с другими науками ( по В.И.Кефели, 1989)

В молекулярной биологии использование биотехнологических методов позволяет определить структуру генома, понять механизм экспрессии генов, смоделировать клеточные мембраны с целью изучения их функций и т.д. Конструирование нужных генов методами генной и клеточной инженерии позволяет управлять наследственностью и жизнедеятельностью животных, растений и микроорганизмов и создавать организмы с новыми полезными для человека свойствами, ранее не наблюдавшимися в природе.

Микробиологическая промышленность в настоящее время использует тысячи штаммов различных микроорганизмов. В большинстве случаев они улучшены путем индуцированного мутагенеза и последующей селекции. Это позволяет вести широкомасштабный синтез различных веществ.

Некоторые белки и вторичные метаболиты могут быть получены только путем культивирования клеток эукариот. Растительные клетки могут служить источником ряда соединений - атропин, никотин, алкалоиды, сапонины и др. Клетки животных и человека также продуцируют ряд биологически активным соединений. Например, клетки гипофиза - липотропин, стимулятор расщепления жиров, и соматотропин - гормон, регулирующий рост.

Созданы перевиваемые культуры клеток животных, продуцирующие моноклональные антитела, широко применяемые для диагностики заболеваний. В биохимии, микробиологии, цитологии несомненный интерес вызывают методы иммобилизации как ферментов, так и целых клеток микроорганизмов, растений и животных. В ветеринарии широко используются такие биотехнологические методы, как культура клеток и зародышей, овогенез in vitro, искусственное оплодотворение. Все это свидетельствует о том, что биотехнология станет источником не только новых продуктов питания и медицинских препаратов, но и получения энергии и новых химических веществ, а также организмов с заданными свойствами.