Методы выделения, культивирования и

идентификации микроорганизмов

В естественных условиях микроорганизмы существуют в смешанных популяциях, ассоциациях и пр. Для установления этиологического фактора инфекционного заболевания бактериологическим методом, требуется выделение микроба в чистом виде. Для этого применяют различные питательные среды из перечисленных выше групп (транспортные, обогащения, элективно-диагностические, дифферернциально-диагностические и пр.) в определенном порядке.

Вначале делают посев исследуемого материала (кровь, фекалии, моча, соскобы розеол, мокрота, носоглоточные смывы и пр.) после определенной его обработки как обычно на среды обогащения и элективно-диагностические (при необходимости перемещения посевов на большие расстояния применяют среды консервирования). Засеянные питательные среды выдерживают при температуре, оптимальной для данного микроба (обычно в термостате при 37⁰ С).

После экспозиции просматривают чашки Петри и выбирают подозрительные колонии (по цвету, форме, размеру, краям колонии и пр. - это диагностические признаки), которые пересевают на скошенный агар, с целью получения чистой культуры в достаточном для дальнейшей работы количестве. Со скошенного агара делают пересев на дифференциально- диагностические среды.

При исследовании на энтеробактерии вводят дополнительные элективные среды (Олькеницкого и пр.), откуда делают пересевы на дифференциально-диагностические среды, с целью определения свойств выделенной культуры: ферментативных, протеолитических, бродильных, токсигенных и других, что является основой в определении вида, подвида и др. качеств исследуемой культуры.

Такая схема выделения микроба и идентификации может длиться 3-4 дня или более в зависимости от вида микроба (свойств). Конечным результатом является выделение штамма и установление его вида, а возможно – серовара, фаговара, антибиотикочувствительности и пр., т.е. проводится не только постановка этиологического диагноза, но и даются некоторые рекомендации для лечения конкретных инфекционных больных.

Чистая культура - это потомство одной микробной клетки, выращенное на питательной среде, т.е. культура моноклона.

Штамм - это чистая культура определенного вида микроба, выделенная в данное время из конкретного материала.

Вид – это категория, обозначающая микроорганизмы, имеющие сходный генотип и несколько различающиеся по фенотипу.

Род - это собирательный термин, обозначающий сходные по генотипу и несколько различающиеся по фенотипу (свойствам) микроорганизмы нескольких видов.

Для культивирования микроорганизмов необходимы не только питательные среды, но и условия изоляции пассируемых микробов от загрязнения.

Это достигается стерильными условиями культивирования.

Посев инокулята

В бактериологической практике нет малозначащих этапов, которые можно исполнить небрежно. Для конечного результата является очень важным: как и в какие сроки был взят материал для исследования и где он был засеян (у постели больного или в лаборатории).

Если материал перевозят в лабораторию, то важно в какие сроки он будет доставлен, каким образом и когда будет сделан посев.

Для каждой инфекции существует инструктивно-методическая литература по режиму и срокам доставки, способам забора материала и пр.

Первым этапом бактериологических исследований является посев исследуемой пробы на элективно-диагностические и среды обогащения. Питательные среды следует выбирать в зависимости от предполагаемых возбудителей и от типа материала (кровь, фекалии и пр.).

Посев проводят петлей (материал наносят у края чашки, затем рассеивают по секторам), шпателем (материал наносят на поверхность агара, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его в поверхность среды), тампоном (тампон с материалом вносят в чашку, делают площадку и круговыми движениями чашки и тампона втирают материал в поверхность среды) и пр.

Для разных целей посевы, например, делают штрихами. Карандашом расписывают сектора на дне чашки и в каждом секторе посевы делают от края чашки к середине штрихами, которые не должны перекрещиваться (обычный посев). Иногда делают посев газоном: 1 мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура) наносят пипеткой на агар и тщательно распределяют по всей поверхности, покачивая чашку. Надписи делают на чашках со стороны дна.

При пересеве из пробирки в чашку Петри, вначале берут пробирку с материалом в левую руку между указательным, большим и средним пальцами, положив ее на ребро кисти. Петлю берут в правую руку как "писчее перо", прокаливают и после остужают внутри пробирки. Пробку пробирки зажимают между мизинцем и ладонной поверхностью кисти правой руки и вынимают на огнем спиртовки, обжигая края пробирок. Вводят петлю внутрь пробирки, прикасаются к краю питательной среды для охлаждения петли, а затем набирают материал с поверхности среды, не повреждая агар.

Затем петлю с материалом вынимают из пробирки, быстро над огнем спиртовки закрывают пробирку пробкой и ставят ее в штатив, немного приподнимают крышку у чашки левой рукой, вводят внутрь чашки петлю, делают небольшую площадку, втирая материал, а затем, поворачивая чашку, засевают штрихами по секторам чашки. Петлю вынимают и быстро закрывают чашку, а петлю стерилизуют над огнем и ставят в штатив.

При посеве из пробирки в пробирку, обе держат в левой руке наклонно, как описано выше. Петлю держат как обычно, прокаливают, затем одновременно вынимают пробки из обеих пробирок, как описано выше. Петлю вводят в пробирку с посевом, набирают культуру и вынимают, вводят в другую пробирку и производят посев штрихами от нижнего края косяка к верхнему.

Если засевают в жидкую среду, то петлю держат некоторое время в этой среде, чтобы культура могла распределиться в жидкости.

При посеве в полужидкий агар делают петлей укол в эту среду. Затем петлю вынимают, закрывают пробками обе пробирки над огнем, стерилизуют петлю и ставят в штатив, а затем ставят и пробирки.

При посеве на скошенный агар, делают штрихи, начиная с нижнего края скошенного агара, с конденсационной воды (если она есть). При посеве на среды Ресселя, Олькеницкого и Клиглера после штрихов делают укол внутрь агара.

При посеве жидкого материала пользуются пипетками или петлей. При посеве пробы для количественного учета микроорганизмов наносят 1 мл материала пастеркой на чашку и шпателем втирают его в поверхность первой чашки, не прожигая шпатель, переносят его во вторую чашку и также втирают, затем и в третью. Лишнюю жидкость отсасывают из чашек пипетками.

Посевы инкубируют в термостате при 37⁰ С (обычно) или при температуре, оптимальной для культуры. Срок инкубации зависит от скорости деления клеток, например, бактерии кишечной группы обычно растут 18-24 ч, холерный вибрион на пептонной воде - 6 ч, другие микробы, например, лептоспиры - до 5-6 дней и т.д.

Изучение изолированных колоний

По истечение определенного срока на засеянных чашках микробы формируют колонии разной морфологии.

Колония - это видимое невооруженным глазом характерное скопление микроорганизмов, выросших на плотной питательной среде как потомство от одной из засеянных микробных клеток.

Это второй этап бактериологического анализа. Морфология выросших колоний - это важный культурально-диагностический признак. Колонии микробов изучают в проходящем свете с помощью лупы или невооруженным глазом. Рассматривают чашку со стороны дна.

Оценивают морфологию по определенным критериям:

• размер колонии (микроскопический, мелкий, средний, гигантский),

• форма колоний (круглые, неправильные, отросчатые и пр.),

• профиль колоний (плоский, выпуклый, куполообразный, блюдцеобразный и пр.),

• характер поверхности (гладкая, шероховатая, морщинистая, изрезанная и пр.),

• прозрачность колонии (прозрачная, мутная, полупрозрачная),

• пигмент (желтый розовый красный, кремовый, перламутровый и пр.),

• структура колонии (гомогенная, зернистая, волокнистая и пр.),

• края колонии (ровные, фестончатые, изрезанные, волнистые, бахромчатые и пр.),

• консистенция колонии (мягкая, сухая, слизистая, сметанообразная, крошковидная),

• тип колонии (круглые, влажные, выпуклые – S-тип, сухие, шероховатые, края неправильные – R-тип, тягучие, слизистые, валик вокруг колонии – М-тип)

На этом этапе часть колонии берут петлей для приготовления мазка. При подтверждении однородности культуру засевают на скошенный агар для накопления и на некоторые среды.

Признаки роста бактерий на жидкой питательной среде:

Рост бактерий на жидкой питательной среде оценивают по нескольким признакам:

1. Наличие пленки (сверху среды, пристеночная и пр.),

2. Наличие осадка (плотный, рыхлый, волокнистый и пр.),

3. Наличие помутнения среды,

4. Комбинация этих признаков.

1. Равномерное помутнение жидкой питательной среды (Shigella и др.),

2. Придонный рост бактерий – осадок на дне. Осадок может быть скудный, обильный, по виду – крошковидный, гомогенный, волокнистый, в виде рыхлых хлопьев, компактный (Cl. botulinum), зернистый (Corynebacterium), войлокообразный (Mycetes), в виде комочков ваты (Bacillus). По консистенции – вязкий, слизистый, хрупкий, пастообразный. Питательная среда над ним может быть: прозрачной (Bacillus) или мутной (Escherichia). Цвет осадка среды определяется пигментами, продуцируемыми культурой. Придонный рост характерен для анаэробов.

3. Пристеночный рост бактерий. Среда прозрачна, а бактерии растут в виде пленки, хлопьев, зерен и пр., прикрепившись к внутренней поверхности стенок сосуда. Снимается с трудом или легко.

4. Поверхностный рост. Этот тип роста характеризуется наличием пленки или едва заметного налета.

а) пленка тонкая, нежная, бесцветная, едва заметная,

б) пленка влажная, толстая, хорошо видимая, вязкая, слизистая, прилипает к петле и тянется за ней,

в) пленка плотная, сухая, напоминает кусочек кожи, снимается целиком в виде диска по диаметру пробирки,

г) пленка плотная сухая, сморщенная бородавчатая, разбивается на кусочки, которые погружаются вглубь жидкости.

Рост бактерий в полужидком агаре

Подвижные микробы вызывают помутнение среды.

Они распределяются практически по всей толще среды.

Неподвижные бактерии растут по ходу укола петлей, образуя разные по форме и размерам помутнения среды – в основном конической или цилиндрической формы с вариациями.

Окружающая среда всегда остается прозрачной.

Пигменты микроорганизмов

Цвет колоний определяется пигментами, которые продуцируют микроорганизмы. Патогенные микробы, в основном, пигментов не образуют и в проходящем свете колонии остаются достаточно прозрачными.

Пигментообразующие виды микробов придают колониям разный цвет: фарфорово-белый, золотисто-оранжевый, красный, синий, сиреневый, черный, зеленый, коричневый и пр.

Известны пигменты двух типов: растворимые в воде и растворимые в органических соединениях. Растворимые в воде пигменты окрашивают среду (Pseudomonas aeruginosa). Наиболее распространены в природе такие пигменты как меланины, каротины, ксантофилы. Первые являются нерастворимыми в воде пигментами, синтезирующимися из фенольных соединений. Они защищают микробы от действия токсичных перекисных радикалов О₂. Многие пигменты бактерий обладают антимикробным действием.

Меланиновые пигменты черного и коричневого цвета, продуцируются бактеройдами.

Хинолоновые пигменты дают желтый цвет, продуцируются микобактериями, кокками.

Пирроловые пигменты дают ярко-красный цвет, продуцируют Serratio marcescens.

Изучение биохимических свойств культур

Биохимические свойства выделенной чистой культуры изучают на третьем этапе или последующем, в зависимости от результатов 2-го этапа. Культуру, выросшую на скошенном агаре, проверяют на чистоту путем микроскопирования мазка, окрашенного по Граму. При этом, изучают морфологию клеток бактерий, их расположение и тинкториальные свойства. При необходимости применяют другие специальные красители. Далее приступают к изучению биохимических и др. свойств чистой культуры, по возможности используя данные микроскопии.

Определение протеолитических свойств. Способность выделенной культуры расщеплять белки протеолитическими ферментами изучают на средах с молоком, желатиной, пептоном, сывороткой и пр.

В процессе ферментации микробами пептонов, образуются индол (C₈H₇N), сероводород (H₂S), аммиак (NH₃) и др. соединения. Для обнаружения сероводорода после посева под пробку помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной уксуснокислым свинцом. При выделении сероводорода бумага чернеет, ввиду образования сернистого свинца (PbS).

Индол определяют с помощью индикаторной бумажки, которую пропитывают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты (C₂H₂O₄). При выделении индола бумажка краснеет. Возможно его определение с помощью реактива Эрлиха.

Аммиак обнаруживают при помощи увлажненной красной лакмусовой бумажки. При выделении аммиака бумажка синеет

Разжижение желатина учитывают при посеве уколом в столбик питательной среды. Те микроорганизмы, которые имеют соответствующий фермент, могут разлагать желатин, При этом, разжиженный желатин может приобретать разнообразные формы (воронки, елочки и пр.).

Просветление молока (пептонизация) осуществляют микробы, разлагающие казеин. Молоко просветляясь, приобретает вид молочной сыворотки.

Определение сахаролитических свойств микробов. Эти свойства определяют на средах Хиса и др. В их состав входит лактоза, глюкоза и др. углеводы. Микробы, сбраживающие

какой-либо углевод, определяют за счет изменения окраски среды в пробирке (это учет образования кислоты). Газообразование определяют по наличию растрескивания агара или пузырьков газа в толще полужидких сред и в поплавках в жидких средах.

Определение ферментов микробов. Метаболические процессы в клетках микробов протекают с участием ферментов. Определенные микроорганизмы имеют индивидуальный

набор ферментов. С помощью ферментов коагулируется плазма крови, может расщепляется соединительная ткань в организме и пр.

Приводим некоторые методы определения ферментов у бактерий, регистрируемые по конечному феномену, получаемому за счет расщепления субстрата.

Гемолизины - разрушают эритроциты, что проявляется просветлением зоны вокруг колонии бактерий на кровяном агаре.

Плазмокоагулаза - коагулирует плазму крови, что проявляется по способности некоторых бактерий свертывать плазму в мелкие хлопья.

Гиалуронидаза - расщепляет NN связи в соединительной ткани, что проявляется в опыте: в пробирку с культурой вносят гиалуроновую кислоту и после 30 мин экспозиции при 37⁰ С добавляют крепкой уксусной кислоты. При наличии фермента бактерий гиалуроновая кислота утрачивает способность образовывать сгусток.

У выделенных бактерий с установлением вида, определяют биовар, фаговар, серовар, хемовар и пр.

Культивирование анаэробных бактерий

Анаэробы - это микроорганизмы с определенным типом метаболизма, исключающим использование кислорода. Способы культивирования, выделения и идентификации таких микроорганизмов существенно отличаются от аэробных бактерий.

Питательные среды для культивирования анаэробов:

1. Анаэробный кровяной агар. Готовится на основе кровяного агара и среды 199 (10 % твин-80), 10 мкг гемина, 5 % цитратной крови и др. ингредиентов.

2. Желточный агар. В среду на основе эритрит-агара добавляют 10 мкг гемина, 0,2 % глюкозы, 20 % суспензию яичного желтка и др. ингредиенты. С помощью среды определяют лецитовителлазную и липазную активность анаэробов. Вокруг выросших колоний анаэробов образуется зона помутнения, а при наличии липазы - зона радужной блестящей видимой при косом освещении опалесценции.

3. Среда для контроля стерильности (СКС). Коммерческая среда. Используется для транспортировки засеянного материала и как среда обогащения.

4. Среда Китта-Тароцци. Готовят на основе бульона Хоттингера с добавлением кусков печени или мяса, разливается по пробиркам. Используют как среду накопления.

5. Среда Вильсона-Блера. Готовится на основе сахарного агара с добавлением 1 % натрия сернокислого и 0,08 % хлорного железа. Среду разливают по пробиркам высоким столбиком. Используется для ускоренной диагностики газовой гангрены.

6. Сахарный агар. Готовится на основе эритрит-агара с добавлением 1 % глюкозы.

Существуют и другие питательные среды для анаэробов.

Анаэробный тип метаболизма гораздо менее продуктивен во времени, чем у аэробов, поэтому культивирование анаэробов требует более богатых питательных сред в более высоких концентрациях.

Методы создания анаэробных условий

Культивирование анаэробов требует не только определенных питательных сред, но и условий их выращивания. Такие условия создаются разными способами:

Химические способы создания анаэробных условий:

1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в среде.

2. Гидросульфат натрия. Для связывания кислорода в 1 л объема берут 100 мл 20 % свежеприготовленного раствора Na₂S₂O₄ и 16 мл 50 % КОН. Эта смесь работает лучше, чем пирогаллол.

3. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в среде (анаэростаты, эксикаторы, прозрачные газонепроницаемые пластиковые пакеты) и пр.

Биологические методы создания анаэробных условий:

1. Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну сторону чашки засевают исследуемый на анаэробы материал, а на другую - культуру аэроба, который способен энергично поглощать кислород. Чашку закрывают крышкой, а края нужно залить парафином. В качестве поглотителя часто используют Serratia marcescens.

2. Помещают в питательную среду кусочки печени или других органов, клетки которых активно поглощают кислород.

Для более тщательного создания бескислородных условий используются анаэростаты, заполняя их после отсасывания воздуха инертными газами.

Выделение чистой культуры анаэробов

Первичные посевы анаэробов делают в анаэробных условиях на среду обогащения (СКС или тиогликолевая среда, Китта-Тароцци), после определенной экспозиции делают высев на плотные питательные среды: сахарный кровяной агар, сахарный агар и др. При появлении роста делают пересев микробов на СКС или Китта-Тароцци для получения чистой культуры.

1. Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной среды, помещают в анаэробные условия при 37⁰ С на 24-72 ч. Колонии пересевают на среду для контроля стерильности или Китта-Тароцци для выделения чистой культуры.

2. Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл 0,85 % раствора хлорида натрия, перемешивают запаянным капилляром и переносят в пробирку с охлажденным до 45-50⁰ С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком После перемешивания этим же капилляром последовательно, без промежуточной стерилизации капилляра, засевают еще 2 пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают. Выросшие через 24-72 ч в глубине агара изолированные колонии засевают на СКС или Китта-Тароцци.

3. Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала в пробирках с сахарным агаром, для чего разливают его по высоким столбиком. В первую пробирку вносят 3-4 капли исследуемого материала, перемешивают запаянным капилляром и не стерилизуя переносят его в другие пробирки. Содержимое пробирок выливают в соответствующие чашки Петри, на дне которых лежит стеклянная пластинка 6х6 см. Среду заливают так, чтобы она попала между пластинкой и дном чашки. При появлении роста бактерий пластинку удаляют, а колонии пересевают на указанные выше среды.

4. Метод Вайона-Виньяла. Готовят разведения исследуемого материала как указано выше в пробирках с сахарным агаром. Пастеровской пипеткой насасывают из каждой пробирки материал, после чего концы пипеток запаивают. После получения роста бактерий пипетку разламывают и переносят в СКС или в Китта-Тароцци.

5. Разновидность метода Перетца. Материал засевают вместе с сахарным агаром на крышку чашки Петри и закрывают донышком чашки. Щель между их краями заливают парафином.

Методы культивирования грибов

Грибы - это аэробы или факультативные анаэробы. Для их культивирования используют специальные среды - Сабуро΄, сусло-агар, овощные среды (картофельные, морковные и пр.) и др.

Среда Сабуро′:

1. агар - 20,0 г

2. пептон - 10,0 г

3. мальтоза (глюкоза) - 40,0 г

4. вода дистиллированная - до 1000 мл.

5. стерилизация в автоклаве 10 мин при 120⁰ С, рН доводят до 5,6-6,0.

Выбор среды проводят, ориентируясь на предполагаемый вид изучаемых грибов, например, дерматофиты лучше растут на агаре Сабуро′, плесени - на среде Чапека-Докса., кандиды - на среде Городковой и др.

Для получения зрелых колоний грибов требуется выращивание их в течение двух-трех недель (кроме дрожжей). Макроморфологию колоний изучают невооруженным глазом и при малом увеличении микроскопа. Учитывают цвет, форму, консистенцию, края и пр. качества колонии. Далее готовят препарат для микроскопии, для чего часть мицелия берут петлей и осторожно переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют. Учитывают расположение мицелия, конидиеносцев, расположение спор и пр.

Методы культивирования вирусов

Вирусы не способны к бинарному делению. Они как облигатные внутриклеточные паразиты, требуют для культивирования живые клетки. Это могут быть культуры клеток, куриные эмбрионы, мыши-сосунки и пр.

Культуры клеток. Культуры клеток впервые применили в 20-е годы прошлого столетия. Но только в 1949 г было экспериментально показано, что культуры клеток поддерживают рост вируса полиомиэлита.

Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяются на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Наилучшими являются клетки перевиваемые, позволяющие проводить достаточно много пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток готовят из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью к делению и длительному размножению in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки Hela, предварительно выделенные из карциномы шейки матки, Hep-3 - из лимфойдной карциномы и нормальные клетки амниона человека, почек обезьян и др.

К полуперевиваемым культурам относят диплойдные клетки человека, представляющие собой клеточную систему, позволяющую проводить до 40-50 пассажей. Диплойдные клетки не претерпевают злокачественного перерождения, чем и отличаются от злокачественных.

Взвесь дезинтегрированных клеток ткани в растворе Хенкса или 199 вносят в чашку Петри (флакон) и оставляют на сутки при комнатной температуре. За это время к стеклу дна прикрепляется монослой клеток, остальные не связавшиеся клетки следует отмывать этими же растворами. Монослой культуры клеток заражают исследуемым материалом, который содержит вирусы. На размножение в культуре клеток вируса указывает цитопатическое действие его на клетки (ЦПД).

ЦПД следует выявлять с помощью методов микроскопии по изменению морфологии данной культуры клеток. Культивирование миксовирусов приводит к слиянию клеток, с образованием синтиция, реовирусы сморщивают и деструктируют клетки. Аденовирусы - агрегируют клетки. Вирусы кори, паротита и парагриппа индуцируют образование гигантских клеток - многоядерных. Риновирусы вызывают образование отдельных участков округлых клеток с отростками.

Некоторые вирусы (краснуха) не вызывают видимых ЦПД, но их определяют по интерференции другого вируса, который обладает способностью вызывать дегенерацию инфицированных клеток. ЦПД вирусов просматривают в динамике. Энтеровирусы могут вызывать ЦПД на 1-2 сутки, другие вирусы на 4-6 сутки.

Индикацию вирусов в культуре клеток проводят методами: гемагглютинации, ИФА, гемадсорбции, нейтрализации и пр.

Метод гемадсорбции предполагает внесение в культуру клеток, зараженную вирусом, взвесь эритроцитов. После отмывания культуры клеток 85 % раствором хлорида натрия все эритроциты, кроме адсорбированных на поверхности пораженных клеток, отмываются.

Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод негативных бляшек Дюльбеко. Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тонким слоем агара. После инкубации на поверхности агара появляются просветленные участки определенной формы (бляшки) на розовом фоне, представляющие собой участки погибших клеток в сплошном монослое культуры клеток. Титр вируса выражается числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

Куриные эмбрионы. Для получения разных препаратов или чистых культур вирусов используют 8-12 дневные куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы в условиях асептики заражают в 3 полости: амниотическую, алантоисную и желточный мешок.

Скорлупу над воздушной камерой обрабатывают 70 % спиртом и обжигают, а затем протирают скорлупу 2 % раствором йода.

Для заражения в алантоисную полость в скорлупе над воздухом проделывают отверстие. Шприцем вводят в него 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 см дальше воздушной подушки. Отверстие в скорлупе заливают парафином.

Заражение в хорион-алантоисную оболочку. Используют эмбрионы 10-12 дневного возраста. Яйцо просвечивают в свете и выбирают бессосудистую область, отмечают локализацию воздушного мешка. Делают искусственный мешок над отмеченным местом, затем снимают скорлупу острым инструментом, освобождают наружную оболочку, которую отслаивают осторожным надавливанием. Делают второе отверстие у края воздушного мешка. Через это отверстие отсасывают воздух и хорион-алантоисная оболочка отслаивается от наружной оболочки. Заражение вируссодержащим материалом (0,1-0,2 мл) делают в оболочку хорион-алантоиса.

Заражение в амниотическую полость. Используют 7-14 дневные куриные эмбрионы. После отслоения хорион-алантоисной оболочки, расширяют отверстие с помощью пинцета, захватывая амниотическую оболочку. Ее выводят через хорион-алантоисную оболочку. Инокулят вводят через эту оболочку непосредственно в амниотическую полость.

Заражение в желточный мешок. Используют 3-8 дневные эмбрионы. В этом возрасте желточный мешок занимает почти всю полость яйца.

Скорлупа обрабатывается как описано выше, делают отверстие в воздушном мешке и вируссодержащий материал вводят в мешок желточный, непосредственно.

Наблюдения за эмбрионами начинают вести через 24-48 ч инкубации при 37⁰ С.

Вскрытие куриного эмбриона производят через 48-72 ч инкубации при 37⁰ С. После обработки спиртом и 2 % раствором йода скорлупу рассекают ножницами немного выше границы воздушной камеры, наклоняя яйцо, чтобы скорлупа не попала в полость

Снимают оболочку и рассматривают хорион-алантоисную оболочку, отмечая очаги поражения.

После вскрытия алантоисной оболочки отсасывают алантоисную жидкость, разливают в пробирки или лунки полистироловых планшет по 0,5 мл. Затем добавляют 0,2 мл 1 % взвеси суспензии отмытых куриных эритроцитов, выдерживают при комнатной температуре до 1 ч.

Учитывают результаты реакции: выраженная гемагглютинация - на ++++ креста, тонкая пленка склеившихся эритроцитов +++, наличие просветов в пленке ++, хлопьевидный осадок (-). Наличие гемагглютинации указывает на присутствие вируса в исследуемом материале.

Лабораторные животные. В основу открытия первых вирусов был положен принцип фильтруемости через бактериальные фильтры (1902).

Макс Тейлор положил начало современному этапу работ в вирусологии, основанное на использовании животных - мышей. В 1948 г Долдофор и Сойклаз применили в работе с вирусами мышей-сосунков.

Для лабораторных исследований обычно применяют белых мышей-сосунков.

А также крыс хлопковых, кроликов, хомяков, обезьян и пр.

Сущность метода состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в эмбрионах или культуре клеток.

К недостаткам относят возможность контаминации животных другими инфекциями, а также не последующее заражение культур клеток для выделения чистой культуры.

Подготовка материала. Жидкие материалы, не содержащие в норме бактерий (кровь, спинномозговая жидкость, сыворотка) могут быть использованы для заражения животных в нативном виде.

Ткани промывают в стерильной воде, нарезают на мелкие куски и измельчают. Затем добавляют растворитель до 10-20 % взвеси. Суспензию центрифугируют при 2000 оборотов в мин в течение 10 мин. Для заражения используют надосадок.

Если материал содержит бактерии (носоглоточные смывы, фекалии, насекомые и пр.), то они должны быть удалены: с помощью антибиотиков, фильтрования через фарфоровые свечи, дифференциального ультрацентрифугирования и пр.

Экспериментальное заражение животных

Экспериментальное заражение животных в лабораторной практике имеет большое значение. Перед опытом их взвешивают, измеряют температуру.

Заражение животных интрацеребральное. Применяют для выделения нейротропных вирусов. Мышей заражают группами по 6 штук, перед заражением их наркотизируют и материал в количестве 0,03 мл вводят в мозг, несколько выше орбитального бугра. За ними ведут наблюдение 2-4 недели. Если животные погибают за этот срок, то мозг и кровь из сердца подвергают бактериологическому исследованию для исключения бактериального загрязнения. Выживших животных забивают и исследуют органы на вирусы.

Интраназальное заражение животных. Наркотизируют животных, материал вводят с помощью капиллярной пипетки в носовые ходы каплями. В дальнейшем получают органы погибших или забитых животных и исследуют их вирусологическими и др. методами, включая гистологию срезов органов.

Подкожный способ заражения. Место инъекции дезинфицируют, предварительно удалив волосы. Кожу захватывают в складку, вводят в нее иглу и медленно впрыскивают материал. Затем складку отпускают, накладывают на место укола вату, смоченную в дез.растворе, быстро извлекают иглу. Уколы делают в область бедра (кроликам), мышам и крысам - в поясницу у корня хвоста.

При внутримышечном способе материал вводят кроликам в мышцу бедра.

Внутрикожный способ. В толщу кожи вводят 0,1-0,2 мл материала туберкулиновым шприцем. На месте введения образуется пузырь.

Внутрибрюшинный способ. Животное держат вниз головой, инъекцию тупой иглой делают в нижнюю часть живота, сбоку от средней линии. Сначала вводят иглу под острым углом, проколов кожу, иглу поворачивают под прямым углом. Толчкообразным движением прокалывают брюшную стенку, при этом ощущается провал в полость.

Внутривенное введение. Кроликам вводят материал в ушную вену. Сдавливают корень уха, чтобы набухли вены. Можно потереть кожу ксилолом и вены будут виднее. После прокола вены иглой, сдавливание корня уха прекращают, жидкость медленно вливают в вену.

Вскрытие животных. Животное умерщвляют эфиром или хлороформом.

В противочумной практике их опускают при помощи щипцов в дез.раствор для уничтожения эктопаразитов и обезвреживания кожи, вынимают и кладут на сетку, чтобы стекал дез.раствор, а затем переносят животное на препаровальный столик. Мышей и морских свинок вскрывают на доске.

Ножницами разрезают кожу от лобка до нижней челюсти и делают разрезы к лапкам. Кожу отпрепаровывают и осматривают.

Паховые лимфоузлы, отрезают часть от них и делают мазок-отпечаток на предметное стекло, а остальную часть засевают в бульон. Делают разрез ножницами грудной клетки, захватив пинцетом отросток мечевидный, ребра прорезают с обеих сторон и перерезают ключичные кости. Осматривают лимфоузлы, легкие, сердце. Часть органов захватывают пинцетом и отрезают, разрезанной поверхностью делают мазки-отпечатки и засевают кусочек органа в жидкие питательные среды. Далее приподнимают пинцетом брюшину у нижнего края и разрезают ножницами снизу вверх.

Проводят осмотр органов и лимфоузлов, а затем с помощью пинцета и ножниц отрезают кусочки органов, делают мазки-отпечатки и кусочки засевают в жидкие питательные среды.

Животных после вскрытия, павших либо погибших во время опыта, следует автоклавировать или сжигать в крематории. Зараженные банки, где держали грызунов, следует обработать 10 % хлорной известью. Подстилку и остатки корма сжигают.

Генетика бактерий

Изменчивость бактерий обусловлена достаточно многочисленными процессами рекомбинаций и мутаций хромосом, а также за счет плазмид, транспозонов, Is-частиц и умеренных фагов. Изменчивость бактерий может быть наследуемой и приводить к появлению новых или исчезновению некоторых свойств бактерий. Мутации условно поделены на естественные и индуцированные, наводимые с помощью мутагенов

Индукция мутаций под воздействием ультрафиолетового облучения

В качестве источника УФ0 используют бактерицидную лампу ВУФ-15, устанавливают ее на расстоянии 60 см от центра облучения объекта. Облучение желательно проводить при красном цвете или в темноте.

Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облучения, на основе которой устанавливают оптимальную мутационную дозу, равную 0,1-1,0 % от числа выживших бактерий.

Для получения lac-мутантов E.coli испытуемую культуру предварительно выращивают в питательном бульоне в течение 14-18 ч. Концентрация бактериальных клеток должна быть 2х10⁸ в 1 мл. Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 м раствора MgSO₄ и охлаждают на льду для прекращения деления клеток. Суспензию в объеме 40 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15 мин при 15⁰ С. После этого клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в питательном бульоне и делают несколько разведений.. Пробирки с питательным бульоном инкубируют при 37⁰ С в течение 14-18 ч. Затем из разведений 10^-2-10^-5 по 0,1 мл высевают на плотную элективную питательную среду (в данном случае - Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем.

Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм E.coli В или К12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика (ампициллин 10 мг на 1 мл, левомицетин 5 мг на 1мл).

На среде Эндо lac-мутанты E.coli образуют бесцветные колонии. Клетки E.coli, которые выросли на среде с указанной концентрацией антибиотиков, являются резистентными к нему. Параллельно делают контрольные посевы этой же культуры без облучения.

Постановка опыта трансформации. Реципиент - Bacillus subtilis Str^S (чувствитльный к стрептомицину). Донор - ДНК, выделенная из штамма Bacillus subtilis Str^R (устойчивый к стрептомицину). Среда - питательный агар, содержащий 100 ED в 1 мл стрептомицина.

В пробирки к 1 мл бульонной реципиентной культуры B.subtilis добавляют ДНК донора (1 мкг на 1 мл) для их инкубации при 37⁰ С в течение 30 мин. Далее в пробирки вносят 0,1 мг на мл раствора ДНКазы в 0,5 мл хлорида магния (для разрушения свободного ДНК) и выдерживают 5 мин. Для определения количества стрептомицин устойчивых бактерий, 0,1 мл неразведенной смеси засевают на питательную среду на чашки Петри. Для определения клеток реципиентной культуры из смеси готовят 10-ти кратные разведения в 0,85 % растворе хлорида натрия до 10^-5-10^-6 (для получения сосчитываемого количества колоний) и высевают по 0,1 мл на питательную среду без стрептомицина, а для контроля - на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная культура не должна расти. Посевы инкубируют при 37⁰ С. На следующий день учитывают результаты. Определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных колоний к числу колоний реципиентного штамма.

Постановка опыта по специфической трансдукции. Реципиент - штамм E.coli lac^-, не имеющий В-галактозидазного оперона, контролирующего лактозу. Трансдуцирующий фаг - фаг dgal, в геноме которого часть генов замещена В-галактозидазным опероном E.coli. Он является дефектным, неспособным вызывать лизис кишечной палочки и обозначается как d(фаг dgal) с названием содержащегося в геноме бактериального оперона gal. Элективная среда - Эндо.

К 1 мл 1 ч бульонной культуры реципиентного штамма вносят 1 мл трансдуцирующего фага в концентрации 10^-6-10^-7 частиц в 1мл. Смесь инкубируют при 37⁰ С в течение 60 мин, а затем готовят ряд десятикратных разведений культуры. Из пробирки с разведением культуры 10^-6 делают высев по 0,1 мл на три чашки Петри со средой Эндо. Посевы инкубируют сутки, затем учитывают результат и вычисляют величину трансформации. Например, после посева 0,1 мл культуры в разведении 10^-6 на трех чашках, где выросло соответственно, 138, 170, 160 бесцветных колоний реципиентного штамма, а на 1 и третьей чашках выросли колонии красного цвета, следовательно, частота трансдукции:

(5+1)х10х10⁶х (138+170+160): 10х10⁶ = 6 :468 = 1^.10^-2

Постановка опыта конъюгации с передачей R-плазмиды. Плазмида контролирует множественную устойчивость к антибиотикам: Str, Tcn, Cmc (стрептомицин, тетрациклин, хлорамфеникол). Донор - штамм E.coli K12 R⁺leu^-Str^RТcn^RCmc^R. Реципиент штамм E.coli K12 R^-leu^-Str^STcn^SCmc^S. Cреда минимальная глюкозо-солевая, содержащая эти антибиотики в концентрации 50 мкг в 1мл каждый.

В стерильную пробирку вносят по 1 мл 3-х ч бульонной культуры реципиента и донора. Смесь инкубируют при 37⁰ С в течение 2 ч и высевают в объеме 0,1 мл в чашки с элективной средой, где вырастают резистентные штаммы. Отсутствие роста донора можно объяснить потребностью в лейцине, а роста реципиента - в чувствительности к антибиотикам. Частоту образования трансконъюгантов определяют отношением их к числу реципиентных клеток. Например, при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма в разведении 10^-4 на глюкозо-солевую среду с лейцином получено 20 колоний, а при высеве смеси - 60 колоний трансконъюгантов. Частота формирования трансконъюгантов:

(60х10) : (20 х 10х10⁴) = 60х10² : 2х10⁶ = 3,0^.10^-4

Определение колициногенных факторов (col-плазмида). Исследуемые культуры E.coli засевают методом укола в питательную среду в чашки Петри (7-8 уколов в чашке). Посевы инкубируют при 37⁰ С в течение суток. после чего на внутреннюю поверхность чашек Петри помещают кусочки ваты, смоченные хлороформом, в парах которого погибают бактерии.

По поверхности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного агара, который смешан с 0,2 мл часовой бульонной индикаторной культуры (чувствительной к данному колицину E.coli). Через 18-20 ч инкубации культуры появляются результаты опыта. Среди посевов индикаторной культуры появляются прозрачные зоны, соответствующие посевам исследуемой культуры.

Определение колицинотипа. В питательный агар в чашках Петри методом укола засевают эталонные штаммы бактерий с известным колицином. Посевы инкубируют при 37⁰ С сутки, после чего культуру убивают хлорамином. Затем по поверхности питательной среды в чашках Петри распределяют 3 мл расплавленного агара, смешанного с 0,2 мл 4-х часовой культурой E.coli неизвестного колицинотипа. Через 18-20 ч культивирования при 37^о С отмечают результаты действия колицина. Если вокруг посевов эталонного штамма появляются зоны просветления в росте исследуемой культуры, то это не будут идентичными колициногенами. В идентичной по колицинам культуре зон просветлений не будет.

Бактериофаг

Вирус, паразитирующий на бактериальных клетках, называют бактериофагом. По греч. phagein – пожирать, выражается в лизисе (растворении) бактериальных клеток. Бактериофаг имеет головку, в которой заключены ДНК или РНК и хвост с отростками.

Известны вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные бактериофаги могут лизировать бактерии с образованием новых фаговых частиц. ДНК умеренных фагов включаются в хромосому бактериальной клетки и передаются по наследству, придавая клетке-хозяину новые свойства. Такое взаимодействие фага с клеткой называют лизогенией, а бактерии, несущие умеренные фаги, называют - лизогенными.

Действие фага строго специфично. Феномен действия вирулентных фагов проявляется просветлением взвеси бактерий в жидкой среде или отсутствием роста бактерий при посеве их на плотную среду газоном.

Большинство фагов проявляет видоспецифичность в отношении бактерий, хотя имеются и вариантные фаги, для определения фаговаров внутри вида бактерий.

На практике фаги применяют для:

1. маркировки культур при эпидемиологическом расследовании, определение фаговара,

2. диффренцировки бактериальных культур, установление видовой принадлежности,

3. фагодиагностики - выделение фага из фекалий больного,

4. фаготерапии - в отдельных случаях фаги применяют для лечения инфекционных заболеваний.

Метод титрования бактериофага:

1. Метод Аппельмана (серийных разведений).

Испытуемый фильтрат или известный бактериофаг разводят 10-ти кратно МПБ. Берут 10 пробирок с 4,5 мл МПБ в каждой. В первую вносят 0,5 мл исследуемого фага, содержимое перемешивают и 0,5 мл жидкости переносят из первой пробирки во вторую, перемешивают содержимое и таким же образом переносят во все следующме пробирки. Получают разведения бактериофага от 10^-1 до 10^-8. В каждую пробирку, включая контроль, вносят по одной капле культуры, выросшей на МПБ. Для контроля берут 2 пробирки с МПБ, в одну вносят 0,5 мл исследуемого фага (контроль на отсутствие бактерий в исследуемом фаге), в другую пробирку - одну каплю микробной культуры (контроль культуры). Все пробирки инкубируют при 37⁰ С в течение 18 ч. Титр фага определяют по наибольшему разведению препарата, в котором обнаруживается литическая активность.

2. Метод Грациа (агаровых слоев).

В 5 чашек Петри заливают 1,5 % МПА с индикатором генцианвиолетом (0,1 мл 0,4 % раствора на 1 л среды). Агар в чашках подсушивают в термостате до полного удаления конденсата.

Готовят разведения исследуемого фага на физиологическом растворе от 10^-2 до 10^-9.

Готовят 5 пробирок, содержащих 0,7 % МПА в количестве 2,5 мл, расплавляют его на водяной бане и охлаждают до 45-50⁰ С. Во все пробирки с МПА вносят 0,1 мл 1 млрд взвеси эталонной суточной культуры и в каждую из пробирок добавляют по 1 мл одного из разведений – 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8 испытуемого фага, перемешивают и добавляют во все пробирки по 2,5 мл 0,7 % МПА, охлажденного до 50^О С. Содержимое пробирок перемешивают и из каждой пробирки смесь вносят вторым слоем в соответствующую чашку с МПА по принципу одна пробирка – одна чашка. Смесь равномерно распределяют по поверхности агара в чашке и оставляют на 50 мин до полного охлаждения агара. Затем чашку слегка подсушивают и инкубируют при 37⁰ С в течение 18-20 ч.

На фоне равномерного роста бактерий отмечают пятна, где рост бактерий отсутствует, что обусловлено лизисом микробной культуры в результате действия бактериофага. При большом количестве бактериофага наступает лизис по всей поверхности агара, при меньших разведениях бактериофага наблюдаются отдельные зоны просветлений, в последней чашке (10^-8) зоны просветления отсутствуют. При определенном допуске, что каждый участок лизиса образован в результате действия одной частицы фага, то можно подсчитать в 1 мл препарата количество активных частиц фага. Допустим, что имеется 30 фаговых пятен, при разведении 10^-7 степени. Следовательно, титр фага равен 3х10^-8, т.е. в 1 мл фага содержится 3х10⁸ активных корпускул фага.

Титрование фага на твердых средах.

Растирают шпателем 1-2 капли молодой агаровой культуры по всей поверхности агара, дают подсохнуть и на разные сектора чашки наносят по 1 капле разных разведений фага, который исследуют. Предварительно, со стороны дна чашки маркируют сектора с фагом. После 18-24 ч инкубирования в термостате следует определять результаты. Титром считают максимальное разведение фага, которое вызвало полный лизис бактерий на данном секторе среды. Метод можно проводить параллельно с исследованием Аппельмана.

Метод выделения бактериофагов

Для выделения бактериофагов из объектов внешней среды готовят фильтрат исходного материала, для чего 3-5 г фекалий размешивают в 50 мл МПБ и инкубируют полученную взвесь при 37⁰ С в течение 18-20 ч. Далее взвесь очищают от взвешенных частиц, путем фильтрования. Освобождение фага от бактерий достигается за счет фильтрования через свечи или асбестовые пластинки. Корпускулы бактериофагов проходят через такой фильтр и обнаруживаются в фильтрате.

Метод фаготипирования бактерий

Испытуемую суточную бульонную культуру бактерий засевают на поверхность питательной среды в чашке Петри. Делят площадь чашки на квадраты (карандашом на дне чашки) и подписывают бактериофаг, который с помощью пастерки наносят на квадрат по одной капле. После инкубации 18-24 ч отмечают на чашке те квадраты, в которых имеется сплошной лизис бактерий.

Фаготип культуры определяется тем типом фага, который вызвал лизис данного штамма.

Специфичность бактериофагов определяют методами Отто и Фюрта.

Метод Отто. Растопленный 3 % мясо-пептонный агар разливают в стерильные чашки Петри, охлаждают, подсушивают в термостате 10-15 мин. Газоном засевают на чашки 16-18 ч бульонную культуру разных бактерий. Наносят каплю известного фага ближе к одной из сторон чашки, затем чашку наклоняют и дают капле фага стечь до противоположного края чашки. Чашки инкубируют при 37⁰ С в течение 18-24 ч и затем учитывают результат. Если фаг гомологичен бактериям в определенной чашке и биологически активен, то по пути стекания капли фага роста бактерий в этой чашке не будет, среда останется прозрачной.

Метод Фюрта. В 15-30 мл МПБ вносят 0,5 мл фекалий и помещают в термостат при 37⁰ С на 24 ч. На другой день МПБ фильтруют через свечу и полученный фильтрат заливают 1,5 % МПА, охлажденным до 50⁰ С. Фильтрат тщательно смешивают с агаром и заливают в чашку Петри, когда агар остынет, подсушивают в термостате.

Дно чашки делят на 8-10 секторов и на каждый из них засевают штрихом бульонную культуру бактерий 3 ч возраста. Чашки ставият в термостат на 37^о С. Результат учитывают через 18-24 ч экспозиции при 37^о С. Если в исследуемом фильтрате есть бактериофаг, то гомологичный микроорганизм на среде расти не будет или только путем отдельных колоний. На секторах, куда засеяли бактерии гетерогенные бактериофагу, будет нормальный рост микробов.

По модификации Фишера, дно чашки делят пересекающимися линиями на тридцать квадратов. В центр каждого квадрата вносят исследуемые бульонные культуры. Результат учитывают через 18-24 ч инкубирования в термостате.

Определение устойчивости и чувствительности бактерий

к антибактериальным препаратам. Микробиологический

контроль антисептиков, дезинфектантов, методов стерилизации

Системой мероприятий, направленных на предупреждение заноса микробов из внешней среды в ткани и полости человеческого организма, в питательные среды, культуры микробов и пр. при лечебных, диагностических, лабораторных и др. манипуляциях, можно создать безмикробные условия при работе с микроорганизмами, различными травматическими манипуляциями и пр.

Методы контроля эффективности стерилизации

Контроль действия высоких температур. В три пробирки с питательным бульоном поместить шелковые нити, смоченные смесью споровой и неспоровой культур. Первую пробирку подвергнуть автоклавированию, вторую - кипячению, третья - контроль. Посевы после этих процедур выдержать при 37⁰ С в течение 24 ч. Отметить рост культур.

Контроль перевязочного материала и хирургического инструментария. Проводят посев исследуемых образцов (смывы с хирургических инструментов, перевязочного или шовного материала и пр.) на три среды: сахарный бульон, тиогликолевую среду, жидкую среду Сабуро. Посевы инкубируют в термостате до 14 дней. При отсутствии роста на всех средах материал считают стерильным.

Изучение антибактериального действия УФ-лучей. Суспензию стафилококка в изотоническом растворе хлорида натрия в объеме 1 мл поместить на стерильное часовое стекло и облучить лампой БУФ-30 в течение 15 мин на расстоянии 10-20 см от центра лампы. Облученную и необлученную (контроль) культуры бактерий засевают в питательный бульон и инкубируют при 37⁰ С в течение 16-24 ч, после чего отмечают результат по росту культур. Отсутствие помутнения среды связано с гибелью бактерий при облучении. В контроле должно быть отмечено помутнение среды, что свидетельствует о росте бактерий.

Определение антимикробного действия антисептических и дезинфицирующих веществ.

А) Подготовить два вида тест-объектов: шелковые нити, смоченные культурой E.coli, и шелковые нити, смоченные спорообразующей культурой. Нити поместить в растворы 5 % фенола, 5 % лизола, 10 % хлорной воды на 5 и 60 мин, после чего отмыть и засеять их в питательный бульон. Инкубировать в термостат при 37⁰ С в течение 18-24 ч. Контрольные тест-объекты не обрабатывать химическими растворами.

Б) Диски из фильтровальной бумаги смочить растворами химических веществ, положить их на поверхность питательной среды в чашки Петри, засеянной тест-культурой газоном. Чашки инкубировать при 37⁰ С в течение 18-24 ч. Об антибактериальном действии судят по зонам задержки роста бактерий, образующихся вокруг дисков.