320

Микроскоп и иммерсионная система

В настоящее время существует несколько типов микроскопов, с соответствующими приспособлениями, позволяющими проводить несколько видов микроскопирования: фазово-контрастное, световое, темнопольное, люминисцентное, электронное.

Микроскоп (греч. micros- малый, scopeo- смотреть) - оптический прибор, который предназначен для увеличения микрообъектов и позволяет изучать микромир, невидимый невооруженным глазом. Применение микроскопов позволяет видеть форму, структуру и размеры объектов от 0,2-0,3 мкм (световые микроскопы), до 0,1-0,2 нм (электронные микроскопы). Именно достижения в области микроскопирования позволили выявить и описать не только бактерии и вирусы, но и такие мельчайшие безъядерные инфекционные частицы как прионы и др.

Световой микроскоп.

В микробиологической практике пользуют световые микроскопы марок МБИ, МБР, Биолам Р-1 и др. Наибольшее увеличение этих микроскопов 900 крат. Микроскопы имеют механическую, осветительную и оптическую части. Механическая часть (тубусодержатель, винты, клеммы, кронштейн, тубус и пр.) предназначена для поддержания и регулирования оптической и световой систем микроскопа. Осветительная часть - зеркало и конденсор с диафрагмой - предназначена для отражения световых лучей с помощью зеркала, после чего лучи направляются к объективу и далее к окуляру, для собирания лучей от зеркала в фокус в плоскости рассматриваемого препарата. Определенную помощь в преломлении лучей света оказывает иммерсионное масло, наносимое на предметное стекло (на мазок). Объем лучей регулируется диафрагмой. Оптическая часть - (объективы, окуляры) предназначена для увеличения объекта исследования, согласно применяемым маркам объективов и окуляров. Объектив- это система линз, дающих основное увеличение. Они маркированы согласно даваемым ими увеличениям, например, х8, х40, х90. Окуляры имеют две линзы: нижнюю - собирательную и верхнюю - главную. Окуляры фокусируют изображение и увеличивают его, согласно маркировке, например, х5, х7, х10, х12, х15. Общее увеличение микрообъекта определяется с учетом маркировки объектива и окуляра, например, объектив х90 и окуляр х10 дают общее увеличение - 900 крат.

Иммерсионная система микроскопа предназначена собрать лучи от источника света в объектив. Объективы световых микроскопов могут быть "сухими" - с большим фокусным расстоянием и бывают "иммерсионными", т.е. погружаемыми в масло. В качестве масла иммерсионного используют кедровое.

Применение иммерсионного масла необходимо для уравнивания показателей преломления света от предметного стекла и пространства между стеклом и объективом. Показатель преломления предметного стекла - 1,52. Показатель преломления воздуха - 1,0, а масла иммерсионного - 1,515. Применение кедрового масла (касторового, вазелинового) предохраняет от рассеивания лучей света, преломляющихся от поверхности стекла. Это увеличивает четкость изображения.

Темнопольная микроскопия. Для этого вида микроскопирования используют те же световые микроскопы, но обычные конденсоры заменяют на специальные (пара-болойд- или кардиойд-конденсор). Темнопольный конденсор характерен тем, что задерживает прямые лучи и пропускает только краевые косые лучи. При сильном боковом освещении получается изображение как бы светящегося объекта на темном фоне. Это эффект дифракции света (Тиндаля). Косые лучи не попадают в глаз исследователя и поле остается темным. В окуляр попадают только те лучи света, которые отражаются от исследуемых объектов. Этим методом удобно исследовать подвижные, плохо окрашиваемые микроорганизмы, в живом состоянии.

Фазово-контрастная микроскопия. Этот вид микроскопирования требует особый конденсор (КФ-1, 4) и специальный осветитель (ОИ-7, ОИ-19 и др.), при использовании обычного микроскопа. Исследование в световом микроскопе нативного неокрашенного микроорганизма практически невозможно. Для этого применяют фазово-контрастное микроскопирование, когда прозрачные объекты приобретают высокую контрастность изображения. Оно может быть позитивным, когда на светлом поле видно темно изображение объекта, и может быть негативным, когда на темном поле видно светлое изображение объекта.

При микроскопировании этими способами освещение должно отвечать требованиям, предъявляемым при световой, фазовой, темнопольной микроскопии, микрофотографирова-нии.

Люминисцентная микроскопия. Люминисценция - это свечение веществ в результате воздействия световым или другими видами излучений. Если освещать люминисцирующий объект ультрафиолетовым светом, то он будет излучать лучи разного цвета. Поскольку таких самосветящихся объектов достаточно мало, то в работе следует применять «вторичную» люминисценцию, т.е. предварительное мечение объекта специальными люминисцирующими красителями - флюорохромами. Обычно флюорохромами метят антисыворотки и тогда свечение собирается вокруг гомологичных по специфичности микробов в виде светящегося ободка. Люминисцентная микроскопия занимает определенную нишу в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, позволяя исследовать микроорганизмы в живом состоянии и малых концентрациях - непосредственно в исследуемом материале

Электронная микроскопия. Для проведения электронной микроскопии применяют специальные, так называемые электронные микроскопы. В электронном микроскопе вместо световых волн используют поток электронов, длина волн которых меньше длины света в 100000 раз. Электронный микроскоп дает увеличение в 100000-200000 раз. Разрешающая способность электронного микроскопа 0,1-0,2 нм. Источником электронов в таком микроскопе является электронная пушка (электронно-лучевая трубка с катодом в виде раскаленной нити и анодом - цилиндром). Электронный микроскоп применяют для изучения тонкого строения микроорганизмов, вирусов, прионов и др. субмикроскопических структур и объектов. Это микроскоп просвечивающего типа. Существуют электронные микроскопы сканирующего типа, с помощью которых проводят изучение рельефного строения внешней поверхности субмикроскопических объектов.

Методы диагностики инфекционных заболеваний

В микробиологии при выделении возбудителя пользуются следующими методами:

1. Бакериоскопический. Суть метода заключается в изучении мазков, приготовленных из исследуемого материала или из посевов микробов, с целью выявления тонкой структуры бактерий, установления морфологии микроорганизмов, чистоты выделенной культуры или индикации, с помощью разных типов микроскопирования.

2. Культуральный (бактериологический). Суть метода заключается в выделении микробов на элективно-диагностических средах, изучении их роста в виде колоний на разных питательных средах, выделении чистой культуры микробов и их идентификации с помощью разных питательных диагностически-дифференциальных сред.

3. Вирусологический. Суть метода заключается в использовании для выделения вирусов культуры тканей, куриных эмбрионов или животных, с целью идентификации выросших вирусов с помощью разных иммунодиагностических или других методов.

4. Биологический. Суть метода заключается в изучении реакции организма животных на введение микроорганизмов, с целью выделении чистых культур некоторых трудно культивируемых микроорганизмов, проведении некоторых иммунодиагностических проб.

5. Иммунодиагностический. Суть метода заключается в выявлении антител в сыворотках крови людей или животных или обнаружении микробов (или их маркеров) в выделениях инфекционных больных, с помощью разных иммунодиагностических методов.

6. Аллергологический. Суть метода заключается в диагностике или контроле эффекта вакцинации людей при использовании аллергологических препаратов, в том числе - из микробов.

7. Молекулярно-генетический. Суть метода заключается в этиологической диагностике инфекционных заболеваний, с помощью методов, основанных на генетической комплементарности зондов и сайтов на ДНК (РНК) исследуемых микроорганизмов и получении их копий, которые идентифицируются.(например, ДНК-зонды, ПЦР и др.).

Методы микроскопии

Метод микроскопии позволяет изучать морфологию микроорганизмов, подвижность, отношение микробов к красителям и пр. Обычно микроскопии подвергают специально приготовленные препараты бактерий в живом или окрашенном виде (фиксированные или убитые микробы). Наибольшее распространение в микробиологии получила микроскопия окрашенных препаратов - мазков, хотя исследование микроба в живом виде имеет свои неоспоримые преимущества.

Микроскопия живых неокрашенных клеток

Для этого применяют два способа: висячей капли и раздавленной капли. Микроскопия живых клеток позволяет изучать бактерии в неизменном виде и обнаруживать подвижность. У крупных бактерий возможно просматривание более тонкой структуры. При микроскопии живых микроорганизмов, следует предпринимать некоторые меры предосторожности.

Висячая капля. Для этого метода применяют специальные предметные стекла, которые имеют углубления в середине. Каплю исследуемого материала помещают на покровное стекло. Затем покровное стекло быстро переворачивают каплей вниз и накладывают на предметное стекло так, чтобы капля свободно свисала над углублением предметного стекла. Возможен еще один вариант: каплю наносят на покровное стекло и сверху накрывают предметным стеклом углублением над каплей. Перед этой процедурой предметное стекло недалеко от углубления смазывают вазелиновым маслом. После этого препарат совмещенных стекол быстро переворачивают, чтобы покровное стекло было наверху. Препарат микроскопируют в темном поле.

Раздавленная капля. На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала и накрывают покровным стеклом. Капля не должна выходить за края покровного стекла.

Возможно окрашивание таких препаратов 0,001 % раствором метиленовой синей или нейтрального красного. Препарат микроскопируют, затем опускают в банку с дез.раствором. Для микроскопирования применяют предметные стекла толщиной 1-1,5 мм, а покровные толщиной - 0,15-0,2 мм.

Приготовление мазка для окрашивания

Изучение микробов в окрашенном состоянии имеет несколько положительных сторон: широкая доступность практике, простота техники обработки, безопасность микроскопии, возможность более подробного изучения их структуры и морфологии.

Приготовление окрашенного препарата имеет несколько последовательных стадий: приготовление мазка, высушивание и фиксирование его, окраска мазка.

Подготовка предметных стекол и мазков. Первым этапом в процессе приготовления мазка является подготовка предметных стекол. Новые стекла кипятят в 1 % растворе соды, промывают водой.

Стекла бывшие в употреблении помещают на 2 ч в концентрированную серную кислоту, после чего кипятят в щелочи (сода, едкий натр), затем промывают водой. Готовые стекла хранят в склянке с притертой пробкой в 90 % спирте. Если они не хранились в спирте, их обезжиривают, например, натирая кусочком сухого мыла, а затем протирают чистой марлей. Капля воды на обезжиренном стекле растекается по поверхности.

Мазок - это небольшая часть исследуемого материала, тонким слоем нанесенная на предметное стекло, с целью последующего изучения морфологии и структуры микроорганизмов. В качестве материала может быть использована кровь, колонии микробов, нативный материал от больных и пр.

Если мазок готовят из бактериальной культуры, выросшей на плотной питательной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю 0,85 % раствора хлорида натрия.

Материал на бактериальной петле вносят в каплю жидкости и круговыми движениями растирают и распределяют его по предметному стеклу в виде круглого или овального мазка, диаметром 1-2 см².

Материал из гноя или мокроты забирают с помощью петли или препаровальной иглы. Выбирают гнойные кусочки и наносят в центр предметного стекла.

Сверху на предметное стекло помещают второе предметное стекло, оставляя свободным левый край.

Взяв за свободные концы предметных стекол, раздвигают их в стороны. В результате чего получаются два мазка на обоих стеклах.

Кровь наносят на предметное стекло в виде капли недалеко от левого края.

Быстро берут второе предметное стекло в правую руку и прикладывают его к нижнему стеклу под углом в 45⁰, затем под этим же углом придвигают к капле крови, которая растекается по его нижнему краю. Плотно прижимая верхнее стекло под таким же углом к нижнему, быстро продвигают его к правому краю нижнего стекла.

На нижнем стекле получается равномерный мазок крови, готовый для светового микроскопирования.

Мазок-отпечаток. Это прикладывание среза органа животных или от человека, во время оперативного вмешательства, к предметному стеклу.

Забор бактериальной массы для приготовления мазка. Микробы извлекают из посевов с помощью бактериальной петли. Это платиновая проволока - один конец которой загнут в виде маленького колечка, а другой вставлен в петледержатель, который и является ручкой. Петлю стерилизуют в пламени спиртовки, после чего ее следует остудить, прикоснувшись к незасеянной части питательной среды перед взятием петлей культуры.

Пробирку с посевом помещают в левую руку сверху на ребро ладони между большим, указательным и средним пальцами в несколько наклонном положении. Должна быть видна вся поверхность питательной среды с культурой. Петлю берут в правую руку как писчее перо. Далее зажимают пробку пробирки правой рукой между мизинцем и поверхностью ладони, прилежащей к мизинцу, и вытаскивают ее над пламенем спиртовки. Обжигают края пробирки над пламенем и вносят стерильную петлю в пробирку, захватывают колечком петли небольшое количество культуры и не прикасаясь к стенке пробирки вынимают петлю. Края пробирки слегка обжигают и закрывают пробкой. Петлю с культурой бактерий вносят в каплю жидкости на предметном стекле и распределяют в виде равномерного мазка. Петлю прожигают и ставят на место, а затем и пробирку с культурой.

Далее проводят подсушивание мазка в токе теплого воздуха горящей спиртовки или при комнатной температуре. Перегрева не допускать. Затем мазок фиксируют, трижды проводя предметное стекло с мазком над пламенем, делая круги диаметром 3 см. В результате этого микроорганизмы должны погибнуть, плотно прикрепившись к стеклу, становясь при этом восприимчивыми к окрашиванию.

Возможна фиксация мазка с помощью химических растворов, потому. что не все препараты можно фиксировать над пламенем (споры, пили, жгутики и пр.). Фиксатор наливают на мазок, либо в раствор погружают предметное стекло с мазком. Наибольшее распространение получили фиксаторы - этиловый спирт (10-15 мин) и смесь Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира), фиксация 10-15 мин. Приготовленные мазки подвергают окрашиванию.

Окрашивание мазка. Для окрашивания мазка применяют анилиновые красители. К настоящему времени описано достаточно много способов окраски мазков.

Существуют простые и сложные методы окраски. Это деление основано на количестве используемых красителей. При применении одной из красок - метод называют простым. При последовательном применении нескольких разных красок, метод называют сложным.

Простые способы можно использовать для индикации определенного штамма в смеси с другими микробами или среди структур крови, тканей и пр. Например, при поиске бруцелл мазок окрашивают карболовым фуксином. Бруцеллы окрашиваются в ярко-красный цвет, а остальные микроорганизмы в сине-голубой. Для простой окраски в основном применяют метиленовую синюю (синий цвет) и фуксин (красный цвет).

Растворы красок наносят на мазок (фуксин на 1-2 мин, а метиленовую синюю на -5 мин). Затем краску сливают, мазок промывают водой, просушивают, микроскопируют.

Применяют фуксин водный и карболовый.

а) карболовый фуксин:

фуксин основной - 1 г

карболовая кислота кристаллическая - 5 г

спирт 96 ⁰ - 1 мл

глицерин - 4 капли

вода дистиллированная - 9 мл

б) водный фуксин:

карболовый фуксин - 10 г

дистиллированная вода - 9 мл

2. Метиленовая синяя. Готовится заранее в насыщенном растворе.

а) метиленовая синяя - 10 г

спирт 96^о - 100 мл

б) щелочная синяя:

насыщенный раствор метиленовой синей - 30 г

едкий натр, 1 % - 1 мл

вода дистиллированная - 100 мл

Сложные методы окраски. Сложное окрашивание применяют для более детального выявления определенных структур микробов, а также для их дифференциации по способу окрашивания и пр. Наибольшее распространение и значение в микробиологии получили сложные методы окраски по Граму и Цилю-Нильсену. Особенно универсальным является метод Грама. Практически все бактерии могут при окраске по Граму проявить себя как грамположительные или грамотрицательные. Это может зависеть от многих причин: наличия клеточной стенки, присутствие в клеточной стенке пептидогликана и т.д.

Метод Грама. Практически все микроорганизмы при окраске по Граму приобретают синефиолетовое окрашивание (это грамположительные) или красное (грамотрицательные). Отрицательность или положительность бактерий при окраске определяется действием на клетку спирта: при отмывании первой краски спиртом, микробы будут грамотрицательными и их необходимо докрашивать второй краской; если первая окраска не отмывается, микробы называют грамположительными и они не нуждается во втором окрашивании. Действие спирта зависит от химической структуры клеточной стенки.

Методика окраски по Граму заключается в следующем:

На фиксированный мазок кладут небольшой кусок фильтровальной бумаги и наливают на него раствор генцианвиолета на 4-5 мин. После экспозиции бумагу снимают пинцетом, краситель сливают.

Наливают на мазок раствор Люголя на 1-2 мин, далее краску сливают.

На мазок наливают спирт 96⁰ на 1 мин, его можно долить еще до прекращения отхождения фиолетового красителя.

Мазок промывают водой.

На мазок наносят раствор фуксина на 1-2 мин и сливают краску.

Мазок промывают водой, обсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Окраска по Граму имеет большое диагностическое значение. К грамположительным бактериям относятся: стафилококки, стрептококки, коринебактерии, микобактерии и др. К грамотрицательным бактериям относятся: менингококки, сальмонеллы, шигеллы, гонококки, протей и пр.

Основная ошибка при окраске - переобесцвечивание спиртом. В настоящее время известна модификация Синева, когда на мазок кладут фильтровальную бумажку, заранее пропитанную генцианвиолетом и высушенную. На такую бумажку наносят несколько капель воды, а остальное - по прописи.

Окраска по Цилю-Нильсену. Она предназначена для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов, например, туберкулезных. Именно эту окраску применяют при выявление туберкулезных палочек в мокроте. Сущность метода заключается в одновременной окраске и разрыхлении клеточной стенки. Последующие манипуляции (обработка кислотой и второе докрашивание) дифференцируют кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии. Прокраске клеток способствует прогревание мазка. Некислотоустойчивые бактерии при обработке спиртом и кислотой обесцвечиваются и докрашиваются метиленовой синей в голубой цвет. Кислотоустойчивые микобактерии приобретают красный цвет.

Окраска по Цилю-Нильсену проводится следующим образом:

На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумажку и наносят раствор карболового фуксина и прогревают мазок до появления паров и еще в течение 5 мин.

Снимают бумажку, промывают мазок водой.

Наносят 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси спирта с кислотой хлороводородной, 1-2 мин для обесцвечивания.

Промывают мазок водой.

Докрашивают мазок раствором метиленовой синей, -5 мин.

Промывают мазок водой.

Метод получил признание и имеет диагностическое значение.

Окраска по Ожешко. Обычными методами споры не прокрашиваются. Сущность метода заключается в предварительном размягчении оболочки споры, а затем окрашивании. При таком способе споры хорошо прокрашиваются и не обесцвечиваются при дальнейшей обработке кислотой. В отличие от спор, вегетативные клетки обесцвечиваются и могут быть видимыми только при дополнительном прокрашивании.

Окраска проводится следующим способом:

Просушенный, но не фиксированный мазок, обрабатывают 2 мин 0,5 % раствором хлороводородной кислоты или соляной.

Прогревают препарат до появления паров, сливают кислоту.

Промывают водой.

Препарат просушивают, фиксируют над пламенем спиртовки.

Препарат обрабатывают карболовым фуксином Циля через фильтровальную бумажку, прогревают до появления паров и еще 4-5 мин. Фильтровальную бумажку следует снять пинцетом, а краску слить.

Мазок обрабатывают 5 % серной кислотой, 1-2 мин.

На мазок наливают метиленовую синюю, 5 мин.

Мазок промывают водой.

Окраска по Шефер и Фултон. Сущность метода сходна с предыдущим, с некоторыми вариациями. Первично проводится не только разрыхление оболочки споры, но и ее окраска. Второй краситель докрашивает вегетативные клетки.

Окраска проводится следующим способом:

На фиксированный мазок наносят 5 % раствор малахитового зеленого и 3-4 раза нагревают до появления паров.

Промывают мазок водой.

На мазок наносят 0,5 % раствор сафранина на 30 сек, с целью докрашивания.

Мазок промывают водой.

При таком способе окраски споры окрашиваются в зеленый цвет, а вегетативная клетка - в красный.

Окраска по Гинсу-Бури. Этот способ основан на двух методах - Бури (окраска фона с помощью черной туши) и Гинса (прокрашивание клетки фуксином). Метод применяют при выявлении у бактерий капсулы. При этом капсула остается неокрашенной, облегая красную клетку (фуксин) или синюю (метиленовая синяя), при этом фон окрашен тушью в темный цвет.

Окраска проводится следующим способом:

На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала. Рядом наносят каплю туши (автоклавированной). Обе капли перемешивают и размазывают по предметному стеклу как при исследовании крови.

Препарат просушивают, фиксируют над пламенем спиртовки.

Мазок окрашивают фуксином водным или сафранином.

Промывают мазок водой.

При этом фон темный, бактерии окрашиваются в красный цвет, их облегает кайма неокрашенной капсулы.

Окраска по Нейссеру. Способ основан на избирательном отношении микробов к щелочным (волютин) и кислым (цитоплазма) красителям.

Окраска проводится следующим образом:

На фиксированный мазок наносят ацетат синьки Нейссера, 2-3 мин.

Не промывая, обрабатывают мазок раствором Люголя, 10-30 сек.

Мазок промывают водой.

На мазок наносят водный раствор везувина или хрезоидина, 0,5 - 1 мин.

Мазок промывают водой.

При таком способе окраски зерна волютина клеток окрашиваются в темно-синий цвет, а цитоплазма докрашивается в желтый.

Окраска по Романовскому-Гимзе. Сущность метода заключается в избирательном окрашивании базофильных и оксифильных элементов клеток.

Окраска проводится следующим способом:

Мазок фиксируют химическим способом.

Раствор краски, приготовленный непосредственно перед употреблением, наносят на мазок, через 1 ч краску сливают.

Промывают мазок водой.

На мазок наносят 10 % раствор метиленовой синей, на 20-30 сек.

Препарат промывают водой.

При этом способе окраски цитоплазма окрашивается в голубой цвет, ядра клеток и зернистость в красно-фиолетовый. Это основной метод изучения морфологии паразитов крови и форменных элементов крови.

Окраска по Леффлеру. Этим способом окрашивают жгутики, вначале протравляя их, а затем докрашивая.

Окраска проводится следующим способом:

Для приготовления мазка используют 10-15 суточные культуры.

Взвесь бактерий готовят на дистиллированной воде, для чего бактериальной петлей берут материал не прикасаясь к конденсационной воде и переносят в пробирку с 2 мл дистиллированной воды.

Не взбалтывая воду в пробирке, держат петлю до полного распределения культуры в воде, образующей тонкую взвесь. Пробирку ставят в термостат при 37^о С на 30 мин.

Предметное стекло проводят над пламенем спиртовки и дают остыть.

Пастеровской пипеткой наносят на стекло 5 капель взвеси и подсушивают на воздухе, а затем быстро проводят над пламенем.

На фиксированный мазок наносят смесь для протравы, подогревая до появления паров, 1 мин.

Мазок промывают водой.

На мазок наносят фуксин Циля, слабо подогревают, 3-4 мин.

Мазок промывают водой.

При таком способе окраски жгутики набухают, становятся видимыми и прокрашенными в красный цвет.

Окраска по Здродовскому. Метод применяют для окраски риккетсий.

Окраска проводится следующим способом.

На фиксированный в пламене мазок наносят водный раствор фуксина Циля, 5 мл.

Не промывая, наносят на мазок 0,5 % раствор лимонной кислоты, 1-3 сек.

Промывают мазок водой.

На мазок наносят 10 % раствор метиленовой синей, 20-30 сек.

Мазок промывают водой.

При таком способе риккетсии окрашиваются в розовый цвет (исключение составляют цуцугамуши, которые окрашивают по Романовскому-Гимзе).

Окраска по Морозову. Способ предназначен для окрашивания вирусов, жгутиков и пр. Еще его называют серебрением.

Окраску проводят следующим образом:

Нефиксированный мазок помещают в стакан с дистиллированной водой и фиксируют раствором № 1, одну мин.

Препарат вынимают из стакана, промывают водой, протравливают раствором № 2 и нагревают до появления паров, 1 мин.

Мазок промывают водой, после чего окрашивают раствором № 3, прогревая его до появления темно-коричневой окраски, 1-2 мин.

При таком способе окрашивания вирусы или жгутики приобретают темный цвет.

Окраска по Муромцеву. Это простой способ выявления телец Негри из суспензии аммониевого рога, полученной растиранием в ступе. Мазок фиксируют в смеси Никифорова.

Промывают мазок водой.

На мазок наносят синьку Мансона, 5-10 мин.

Промывают мазок 10 % раствором танина, 2-3 мин.

Наносят на мазок спирт 100^о на 1,0 мин, сливают и просушивают.

При таком способе окраски тельца Негри окрашиваются бледно-фиолетовым цветом на бесцветном фоне.

Прописи некоторых красителей и растворов

Синька Леффлера:

насыщенный спиртовый раствор метиленовой синей - 30 мл

КОН 10 % - 1 мл

дистиллированная вода - 100 мл

Краситель Нейссера:

1. метиленовая синяя - 0,1 г

спирт 96^{0 -} 2 мл

крепкая уксусная кислота - 5 мл

дистиллированная вода - 100 мл

2. везувин - 2 г

спирт 96⁰ - 60 мл

дистиллированная вода - 40 мл

Смесь кипятят, по охлаждении фильтруют.

Краситель Морозова:

Раствор № 1 (жидкость Рунге):

ледяная уксусная кислота - 1 мл

формалин 40 % - 2 мл

дистиллированная вода - 100 мл

Раствор № 2 (протрава):

танин - 5 г

карболовая кислота жидкая - 1 мл

дистиллированная вода - 100 мл

Раствор № 3 (краситель):

азотнокислое серебро - 5 г

дистиллированная вода - 100 мл

4. Краситель Романовского-Гимзе:

Содержит смесь красителей: метиленовая синяя, эозин, азур. К 10 мл воды дистиллированной, рН 6,8-7,0, перед окраской добавляют 10 капель краски и тотчас наливают на мазок.

5. Краситель по Граму.

1. карболовый генцианвиолет:

генцианвиолет - 1 г

кислота карболовая - 2 г

спирт 96⁰ - 10 мл

дистиллированная вода - 100 мл

2. раствор Люголя:

калий йодистый - 2 г

йод кристаллический - 1 г

дистиллированная вода - 300 мл.

Морфология и структура микроорганизмов

Микроорганизмы достаточно многообразны по морфологии, однако, с определенными натяжками их можно поделить на несколько групп: кокковидные, бактериевидные, вибриоспировидные, мицелиевидные, вирусовидные, протистовидные. Эти группы могут делиться на подгруппы. Различия морфологии микробов между этими группами и внутри их имеет определенное диагностическое значение.

Кокковидные. Это бактерии шаровидной формы. Скорости их размножения и расхождения клеток различны, что отражается на расположении кокков в мазках. Различают несколько разновидностей расположения кокковидных. Если бактерии быстро расходятся после деления и в силу этого располагаются в мазке в виде монококков (по отдельности), то их называют микрококки. Если кокки делятся в одной плоскости и недостаточно быстро расходятся, то в мазках они выглядят как диплококки, т.е. парные кокки. При меньшей скорости разделения бактерий образуются цепочки кокков, имеющие родовое название - стрептококки.

Если бактерии делятся в трех плоскостях и медленно расходятся, то в мазках с плотной агаровой среды они образуют характерные скопления в виде гроздьев винограда и имеют родовое название - стафилококки. Тетракокки образуются в результате деления в двух плоскостях и благодаря относительно не высокой скорости расхождения кокков - в мазках образуются четверки кокков по две пары. Сарцины - это кокки, которые расположены в мазках в виде пакетов или тюков, по 8, 16, 32 и более клеток, при делении родительской клетки сразу в нескольких плоскостях.

Среди кокковидных - стрептококков, стафилококков, диплококков имеется достаточно много видов бактерий, патогенных и условно-патогенных для человека. Например, вид Saphylococcus aureus вызывает у человека около 100 заболеваний - от юношеских угрей до перитонита, сепсиса и др. Диплококки - Neisseria gonorrhea вызывают у человека гонорею, а Neisseria meningitidis -менингит и др. Стрептококки вызывают гнойные поражения тканей - рожа, ревматизм и др.

Бактериевидные. Эти бактерии представлены цилиндрическими или палочковидными формами бактерий.

В 1875 г немецкий ботаник Г. Кон обнаружил у сенной палочки споры и стал именовать бактериевидные формы, образующие споры - бациллами, а культуры не образующие споры - бактериями. Образующие споры палочки, которые имеют веретенообразную форму, назвали клостридиями. По расположению клеток бактерий различают: диплобактерии - располагающиеся в мазках попарно и стрептобактерии - располагающиеся в виде цепочек. Бактериевидные различаются по длине, ширине, форме концов, расположению спор и пр. Некоторые бактерии окрашиваются по Цилю-Нильсену (микобактерии), а остальные - по Граму.

Среди бактериевидных следует особо выделить микоплазмы. Микоплазмы отличаются отсутствием клеточной стенки. Это мелкие, Грам (-) бактерии (0,12-0,25 нм), содержащие трехслойную ЦПМ. Они чувствительны к осмотическому давлению и нечувствительны к пенициллинам, ввиду отсутствия пептидогликана. Микоплазмы полиморфны. Имеют 92 вида, часть из них патогенны для человека.

Бактериевидные вызывают множество разнообразных заболеваний у человека: гнойно-воспалительные, дизентерию, сальмонеллезы, пневмонии, сибирскую язву, чуму, дифтерию, коклюш и др.

Вибриоспировидные. Это подвижные бактерии, имеющие извитую и спиралевидную формы. В мазках имеют несколько морфологических форм: извитые - четверть витка спирали, спириллы - в виде нескольких крупных завитков спирали, спирохеты - имеющие несколько мелких витков спирали. Извитые имеют один жгутик (Vibrio cholerae).

Таблица 8.

Морфологические признаки спирохет

Род	Количество завитков	Характер движения	Окраска по Рома- новскому-Гимзе
Borrelia	3-10 крупных, неравном.	толчкообразные, сгибате- льные, поступательные	сине-фиолетовые
Treponema	8-14, среднекрупных	плавное, сгибательное, вращательное, поступательн.	бледно-розовые
Leptospira	Многочисленные первич- ные, S-образные, вторичн.	активное вращательно- поступательное	розово-сиреневые

Спирохеты в зависимости от количества и формы завитков подразделяют на три формы: трепонемы – имеют до 14 средне-крупных завитков, лептоспиры - множество мелких завитков, боррелии – 3-10 крупных, неравномерных завитков.

Среди вибриоспировидных встречаются виды бактерий, проявляющие патогенные свойства в отношении людей: вызывая боррелиозы, лептоспирозы, сифилис, холеру и пр.

Вирусовидные. Это внутриклеточные генетические паразиты. Внеклеточную форму вирусов называют вирионом. Они имеют палочковидную или сферическую форму, проходят через бактериальные фильтры. Размеры варьируют от 15 до 500 нм. К вирусовидным относят разнообразные вирусы, в том числе – дефектные вирусы. Все вирусы делят на семейства и подсемейства и роды. Патогенные для человека и животных вирусы составляют 20 семейств. Вирусы делят на РНК и ДНК содержащие. Вирусы - это одна из мельчайших форм существования жизни. Они являются паразитами не только животного и растительного миров, но и микрофлоры, включая вирусы. На сегодня самая маленькая инфекционная частица - прион. Это белковая частица, которая не имеет генетического материала, но проявляет инфекционные свойства. Заболевания у человека и животных, вызываемые прионом, поражают мозг, с обязательным смертельным исходом.

Мицелиевидные. Это огромная группа, объединенная на основе общности многих признаков и образа жизни. Мицелий у микроорганизмов этой группы бывает воздушный и субстратный. Представители группы делятся на две неравноценные подгруппы: грибы и актиномицеты (таблица № 9).

Таблица 9

Морфологические признаки некоторых грибов

Род	Мицелий		Споры
	вегетативный	репродуктивный	тип	расположение
Mucor	несептированный	спорангиеносец	эндоспоры	в спорангии
Aspergillus	септированный	конидиеносец	экзоспоры-конидии	в виде лейки
Penicillum	септированный	конидиеносец	то же	в виде кисточки

Актиномицеты имеют вид длинных несептированных гиф, не образуют спор и жгутиков.

Грибы бывают низшие и высшие. Имеют дифференцированное ядро, способны к половому и бесполому видам размножения.

Среди этой группы имеются виды, патогенные для людей. Актиномицты вызывают у восприимчивых людей актиномикоз, а грибы - микозы.

Протистовидные. Это многочисленная группа одноклеточных микроорганизмов, распространенных в природе. Они могут быть шаровидной, овальной, сплюснутой или разветвленной формы, размером 5-20 мкм. Обычно подвижные и пластичные, образуют цисты в неблагоприятных условиях. Наиболее широко распространены жгутиконосцы, саркодовые, инфузории реснитчатые. Среди саркодовых имеются амебы раковинные и голые.

Протистовидные имеют виды, патогенные для человека, вызывая, например, амебную дизентерию.

Способ измерения микробной клетки

Микроскопические объекты измеряют в нанометрах (нм) или в микрометрах (мкм). В 1 мкм содержится 1000 нм, в 1 мм содержится 1000 мкм. Для измерения клеток применяют окуляр-микрометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр - это стеклянная пластинка в окуляре, на которой в центре нанесена шкала с 50 делениями. Объект-микрометр - это стекло, в центре которого находится шкала, поделенная на 100 частей. Обычно каждое деление шкалы содержит 10 мкм.

Объект-микрометр устанавливают на предметный столик, передвигая который винтами совмещают одно из делений с одним из делений окуляра-микрометра. Отмечают число делений объект-микрометра, в которые укладывается полное число делений окуляр-микрометра. Этим устанавливается величина делений окуляр-микрометра. Заменяют объект-микрометр на исследуемый препарат, размеры которого определяют линейкой окуляр-микрометра.

Структура микроорганизмов

Клетки микроорганизмов имеют внутренние и поверхностные структуры, среди которых различают обязательные и встречающиеся только у определенных групп микробов.

Строение бактериальной клетки. К внутренним широко распространенным структурам относят: цитоплазму, генофор, включения, рибосомы. К внешним обязательным структурам относят ЦПМ и клеточную стенку (за небольшим исключением). Необязательными для многих микроорганизмов внутренними структурами являются волютиновые зерна и спора, а внешними - капсула, жгутики, пили и пр.

Генофор или нуклеойд. Он содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) в форме свернутого кольца. ДНК называют хромосомой по аналогии с эукариотами. Генофор основной носитель генетической информации в клетке. Состоит из набора генов, которые расположены в определенном порядке. Кроме ДНК в клетке могут находится плазмиды и др. внехромосомные генетические структуры.

Цитоплазма. Это внутренняя среда клетки, в которой располагаются генофор (ДНК), рибосомы, полисомы, включения, ферменты, плазмиды.

Рибосомы состоят из РНК и белка. Они участвуют в процессе синтеза белка.

Гранулы содержат запасные вещества. Гранулы волютина окрашивают по Нейссеру.

Клеточная стенка. Это внешняя структура клетки, имеет неодинаковое строение у разных групп бактерий. В зависимости от строения клеточной стенки микроорганизмов, они могут окрашиваться как грамотрицательные или грамположительные. Это определяется количеством пептидогликана и других составных клеточной стенки.

Цитоплазматическая мембрана. Обязательный внешний элемент бактерий. Отделяет цитоплазму от клеточной стенки. Имеет трехслойную структуру. Это белково-липидный комплекс. ЦПМ полупроницаема и регулирует транспорт веществ в бактериальную клетку. Участвует в образовании мезосом. Это важный элемент клетки.

Споры. Это тельца сферической или эллипсойдной формы, устойчивые к воздействию неблагоприятных факторов, образуемые некоторыми бактериями. Их называют бациллами. Споры образуют такие роды как Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, отдельные кокки и спириллы. Спорообразование начинается, когда микробы испытывают недостаток в питательных веществах. Споры сохраняются в таких условиях, когда вегетативные клетки гибнут. В благоприятных условиях спора вновь может прорастать в вегетативную клетку, т.к. содержит генетический материал. Споры окрашивают по Ожешко.

Жгутики. Структурный элемент, предназначенный для движения бактерий в жидких средах. Бактерии могут иметь один жгутик и их называют монотрихии (Vibrio cholerae), один пучок жгутиков на одном конце - лофотрихии, по пучку жгутиков на обоих концах клетки - амфитрихии, множество жгутиков вокруг клетки - перетрихии. Жгутики окрашиваются по методу Леффлера.

Фимбрии. Внешний структурный элемент, короче и тоньше жгутиков, которые в большом количестве окружают клетку как "бахрома". Выполняют роль факторов адгезии, прикрепляясь к определенным рецепторам других клеток.

Пили. Внешний структурный элемент. В зависимости от функции и структуры, пили поделены на несколько типов. Пили 1, 3 и 4 типа функционируют как факторы адгезии. Более длинные пили, со структурой полого цилиндра, участвуют в переносе генетического материала от одной бактериальной клетке к другой.

Капсула. Является внешним структурным элементом. Это сложный комплекс таких соединеиий как полисахариды и полипептиды. Капсула не окрашивается анилиновыми красителями. Она не препятствует проникновению в клетку питательных веществ, являясь защитным слоем для клетки. Капсула препятствует фагоцитозу бактерий. Для обнаружения капсулы мазок окрашивают по комбинированному методу Гинса-Бури.

Вирусы. Это ультрамикроскопические облигатные внутриклеточные паразиты. Они были открыты в 1892 г Д.М. Ивановским. Вирусы содержат нуклеиновые кислоты одного из двух типов (ДНК или РНК). Нуклеиновая кислота окружена чехлом из белков, называемых капсидом. Структурный элемент, состоящий из белков и нуклеиновой кислоты, называют нуклеокапсид. Капсомеры - комплекс капсида и вирусного генома. Они скомпонованы по двум типам симметрии: сферической и спиралевидной. Некоторые вирусы на поверхности имеют шипы, образованные белками - гемагглютининами и нейраминидазой. Вирусы окрашивают по Морозову.

Актиномицеты. Клетки актиномицет имеют те же структурные элементы, что и бактерии: клеточную стенку, ЦПМ, в цитоплазме содержится нуклеойд, рибосомы и пр. элементы. Основным морфологическим признаком актиномицетов является ветвящаяся форма клеток, имеющих вид коротких палочек или длинных нитевидных образований, напоминающих мицелий грибов. Мицелий бывает у актиномицетов субстратным или воздушным.

Размножение актиномицетов происходит вегетативным путем (обрывками мицелия) и спорами. Спороносцы актиномицетов бывают волнистыми, прямыми и спиральными.

Среди актиномицетов встречаются сапрофитные и патогенные виды. Почвенные виды актиномицетов продуцируют многочисленные антибиотики.

Грибы. Имеют микро- и макроскопическое строение. Длинные нити - гифы, которые переплетаясь, образуют мицелий. Споры грибов располагаются внутри мицелия или внутри его. Плодоносящие гифы грибов Aspergillus и Penicillum называют конидиеносцами. Аскоспоры находятся в асках - сумках. Бластоспоры образуются в результате почкования клетки. Среди грибов различают высшие и низшие. Считают, что известных грибов более 500000 видов.

Питательные среды

Питательные среды - это искусственно приготовленный комплекс питательных веществ, предназначенный для культивирования микроорганизмов. Это искусственно приготовленная среда обитания микробов. Такие питательные среды обычно готовят на определенной основе (агар, мясо-пептонный бульон и пр.), с учетом пищевых потребностей культивируемых на них микробов. Они бывают простого и сложного состава и готовятся для лабораторных или промышленных целей.

Питательные среды должны:

Содержать в нужном количестве весь набор элементов, которые предназначены для восполнения структуры микроорганизмов. Они должны быть в усвояемых химических соединениях: многоатомные спирты, углеводы, органические кислоты и пр. - это источники углерода; аммонийные соединения, аминокислоты, белки, пептиды - источники азота; соли фосфорной и др. кислот - источники микроэлементов; витамины и др. - факторы роста, а также должны содержать соли, воду.

Иметь оптимальную: влажность (не мене 20 % воды), вязкость, рН среды (диапазон от 4,5 до 8,5), изотоничность (для большинства - 0,85 %, для голофилов - 3 %), окислительно-восстановительный потенциал Rh (для анаэробов 0,120-0,060, для аэробов более 0,90).

Питательная среда должна быть прозрачной.

Питательная среда должна быть стерильной.

Питательные среды по консистенции могут быть жидкие и полужидкие (0,3-0,7 % агара) и плотные (1,5-2,0 % агара).

Для приготовления питательных сред применяют естественные продукты животного, яичного, рыбного и растительного происхождения или искусственные ингредиенты в строго определенных количествах и такие среды называют синтетическими, а при добавлении к ним еще и естественных продуктов - полусинтетическими. Питательные среды из естественных продуктов имеют неопределенный химический состав и требуют добавок некоторых веществ - ингибиторов посторонней флоры и пр. В состав питательных сред на синтетической основе входят аминокислоты, витамины, минеральные соли и др. известные химические элементы в известных количествах. В полусинтетические среды кроме известных элементов входят пептон, дрожжевой экстракт и др. вещества.

Питательные среды по назначению бывают: консервирующие, обогащения, элективно-диагностические, универсальные и дифференциально-диагностические.

Консервирующие или транспортные среды предназначены для транспортировки в баклабораторию материала первично засеянного у постели больного.

Универсальные среды предназначены для роста неприхотливых микробов или добавки таких сред как основы к более сложным.

Среды обогащения предназначены для накопления одних микробов при подавлении роста других, что бывает очень важным, т.к. первичный материал часто засевают на твердые среды и обогащения одновременно.

Элективно-диагностические среды предназначены для первичного выделения групп или родов микроорганизма с целью последующей дифференцировки и идентификации на других средах.

Дифференциально-диагностические среды предназначены для окончательного ответа о виде и подвиде выделенной чистой культуры.

Элективность диагностических сред выделения бактерий достигается за счет добавления в их состав определенных ингибиторов для других видов микроорганизмов (желчь, азид натрия, теллурит калия, рН, соль, антибиотики и др. вещества). Проводимая далее с чистой культурой дифференциальная диагностика бактерий основана на определении особенностей, например, биохимических и др., путем внесения в среду определенных субстратов (сорбита, мальтозы, сахарозы и др. - это углеводы; орнитина, лизина, аргинина и др. – это белки; солей, мочевины и пр.).

В настоящее время на разные группы микробов выпускают в стране и за рубежом тесты нескольких поколений и порядков: 1-порядка - тест-система, расфасованная по лункам полистироловых пластин питательная среда (АР1-20E, Eneroes, MMТE1 и др.). 2-порядка - системы в бумажном индикаторном исполнении (Micro-10, M:N:ТEK и др.), 3 -порядка - тест-система жидкая, приготовленная ex тempore.

Приготовление питательных сред

Ввиду множества прописей приготовления питательных сред, в этом разделе приводим примеры приготовления наиболее распространенных из питательных сред.

Компоненты для питательных сред. Натуральные питательные среды целиком состоят из животного сырья (свернутая сыворотка, кровь и др.) или с наполнителем (агар, пептон, желатин и др.). Для питательных сред используют: картофель, кровь, молоко, яйца, рыбную муку, дрожжи и пр. и готовят из них экстракты и настои (полуфабрикаты, гидролизаты и перевары, например, Хоттингера) и пр. Это источники белковых, азотистых и др. веществ. В качестве минеральных солей используют: NaCI, KHPO_4, MgSO4 и др. В качестве сахара – глюкозу либо лактозу, мальтозу, сахарозу и пр. Из индикаторов применяют Андреде (0,5 г кислый фуксин, 1N NaOH 17 мл, дистиллированная вода до 100 мл), Кларка (1,5 % раствора фенолового красного, метиленового красного, бромтимолового синего и др.), а также нужно использовать аминокислоты, витамины и др. ингредиенты.

Для искусственных сред применяют определенные элементы в строго известных дозах, которые оптимальны для конкретных микроорганизмов.

Некоторые рецепты приготовления питательных сред:

Транспортные среды.

1. Среда с теллуритом калия. Агаровую основу 0,1 % разливают в пробирки по 4 мл. Стерилизуют при 1 атм 20 мин. В каждую пробирку по правилам асептики вносят 0,5-1,0 мл сыворотки КРС и по 0,05 мл 2 % раствора теллурита калия. Срок хранения 10 дней.

2. Среда Тига (глицериновая смесь). Смешивают 1 л глицерина и 2 л 0,85 % раствора хлорида натрия и 15-20 % раствора фосфата натрия в количестве, чтобы рН был 7,8-8,0. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд или 20 мин при 0,5 атм.

3. Глицериновый консервант. Это разновидность глицериновой смеси, с содержанием солей лития.

Среды обогащения.

1. Селенитовая среда. Смешивают пептон- 0,5 г, селенистокислого натрия - 0,4 г, фосфата натрия однозамещенного - 0,7 г, фосфорнокислого двузамещенного натрия - 0,7 г, лактозы - 0,4 г, дистиллированной воды - до 100 мл. Разливают по пробиркам и флаконам, стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.

2. Среда Мюллера. В стерильные флаконы отвешивают 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром, наливают 90 мл бульона и стерилизуют 30 мин при 1 атм. К каждому флакону в асептических условиях добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора гупосульфита натрия.

Раствор Люголя: дистиллированная вода 20 мл, йодида калия 20 г, йода 25 г. После растворения доливают дистиллированной воды до 100 мл. Раствор гипосульфита натрия: в мерный цилиндр насыпают 50 г гипосульфита натрия и добавляют дистиллированной воды до 100 мл, перемешивают, переливают в бутыль, стерилизуют текучим паром.

Универсальные среды.

1. Мясо-пептонный бульон.

а) Приготовление мясного экстракта:

500 г мяса (без костей, жира и сухожилий) разрезают на мелкие кусочки (пропускают через мясорубку), заливают 1 л водопроводной воды. Выдерживают сутки в холодильнике или 2 ч в термостате при 37⁰ С. Отжимают мясо через марлю, кипятят на огне 5 мин и дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема

б). Приготовление мясопептонного бульона:

В 1 л мясной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г (1 %) пептона и 5 г (0,5 %) поваренной соли. Устанавливают слабощелочную реакцию 10 % раствором соды с помощью лакмуса (красная лакмусовая бумага слегка синеет). Кипятят 30-40 мин на огне. Дают остыть, фильтруют через бумажный фильтр и доливают водой до первоначального объема. Определяют концентрацию водородных ионов калориметрическим путем - в компараторах, подправляют рН 10 % раствором щелочи или уксусной кислоты. Кипятят, остужают, фильтруют, разливают по 5-6 мл в пробирки и по 50-100 мл в колбы, стерилизуют до 20 мин в автоклаве при 120^о С.

2. Приготовление мясопептонного агара:

К бульону прибавляют 2- 3 % измельченного агара, нагревают до растворения агара, остужают агар до 50⁰ С. Для осветления вносят белок 1 куриного яйца, смешивают его с двойным объемом холодной воды и вносят в агар, автоклавируют 45 мин при 115⁰ С для осаждения хлопьев белка. Фильтруют агар еще не остывший, разливают в стеклянную посуду. Вновь стерилизуют в автоклаве 20 мин при 120⁰ С. Готовят скошенный или прямой агар, остужая пробирки (флаконы, колбы) до застывания агара.

3. Приготовление перевара (гидролизат) Хоттингера:

а) Мясо (1 кг) нарезают кусочками, добавляют двойной объем воды и кипятят 15-20 мин, извлекают, пропускают через мясорубку и опускают снова в тот же бульон, подщелочив его до рН 8,0. Охлаждают до 40⁰ С, добавляют поджелудочную железу, пропущенную через мясорубку, в объем 100 г на 1 л воды.

б) Фарш перемешивают, подщелачивают, переливают в бутыль с плотной резиновой пробкой, оставляют треть бутылки свободной. Вносят 1-3 % хлороформа, закрывают бутыль, встряхивают, открывают бутыль на 1 мин для выпускания хлороформа

в) Проверяют рН (через 1 ч после добавления фермента) и подщелачивают до рН 7,4-7,6. Смесь оставляют на 10-16 дней при комнатной температуре. Первые дни подщелачивают и встряхивают. За несколько дней до окончания экспозиции бутыль не встряхивать.

г) Правильный перевар будет иметь пылевидный осадок и соломенно-желтый раствор. Содержание азота 11,00-12,00 г на 1 л. Перевар фильтруют через полотнянный фильтр или бумажный, разливают в бутыли и колбы и стерилизуют в течение 30 мин при 120⁰ С.

4. Приготовление бульона Хоттингера:

К 100 мл перевара Хоттингера добавляют 800 мл дистиллированной воды, вносят 5 г хлористого натрия, 0,2 г однозамещенного фосфорнокислого натрия, устанавливают рН 7,4-7,6. Разливают в колбы и пробирки. Стерилизуют в течение 20 мин при 120⁰ С. Содержание аминного азота - 1,00-1,20 г на 1 л.

5. Приготовление агара Хоттингера:

К 1 л бульона Хоттингера в колбе объемом 2-3- л прибавляют 18-25 г мелко нарезанного агара (1,5-2,0 %). Будьон кипятят, постоянно его перемешивая, до расплавления агара. Устанавливают рН 7,4-7,6 . Расплавленный агар фильтруют через несколько слоев марли и разливают в колбы и пробирки. Посуду расставляют в специальную тару и стерилизуют в течение 20 мин при 120⁰ С в стерилизаторе. Затем стерильный агар в посуде используют для посева микроорганизмов или расплавляют, разливают в более мелкую посуду и вновь стерилизуют.

Элективно-диагностические среды.

1. Пептонная вода:

В воду добавляют 1 % пептона (1 г на 100 мл воды), устанавливают рН 8,0, разливают по 15 мл в пробирки, стерилизуют 20 мин при 120⁰ С. Среда предназначена для роста холерных вибрионов, при ингибиции остальных бактерий.

2. Желточно-солевой агар.

а) Агар мелко измельчают (1,8-2,0 г), добавляют 100 мл дистиллированной воды, рН 7,1-7,2, прогревают до расплавления агара, остужают до 50⁰ С.

б) Соблюдая правила асептики, вносят 20 % желточную взвесь (желток, асептически извлеченный из куриного яйца, взбалтывают в 200 мл изотонического раствора хлорида натрия).

в) Взвесь смешивают, разливают по 20 мл в чашки Петри. Хранят в холодильнике до употребления (две недели). Используют как элективную среду для выделения стафилококка.

2. Среда Китта-Тароцци

Бычью печень или другие органы (можно плаценту) нарезают мелкими кусочками, заливают трехкратным количеством МПБ, рН 7,4-?,6, кипятят 30 мин. Бульон фильтруют, а печень промывают водопроводной водой, просушивают с помощью фильтровальной бумаги. Распределяют по пробиркам по 3-4 г печени и по 7-8 мл МПБ. Стерилизуют 30 мин при 1 атм. Применяют для выделения анаэробов.

Элективными являются среды для первичного выделения энтеробактерий: Плоскирева (угнетает рост многих бактерий, способствует росту сальмонелл и шигелл), Эндо (различает лактозо (+) и лактозо (-) бактерии кишечной группы), висмут-сульфит агар (элективен для сальмонелл, ингибирует рост других бактерий) и пр.

Среда П-2.

Применяется для выделения протея. В 100 мл растопленного 2 % агара добавляют 3 мл дрожжевого экстракта, 1 г маннита, 1 г мальтозы, 0,8 г желчных солей, 0,2 г цитрата железа аммонийного, 0,05 г гипосульфата натрия, 2,5 г/мл 0,01 % раствора кристаллического фиолетового, 0,5 мл щелочного раствора фенолового красного, рН 7,4-7,7. Стерилизуют при 0,5 атм 15 мин. Добавляют 10-12 тыс ЕД полимиксина М. Разливают в чашки Петри. Среда имеет красно-коричневый цвет.

Для выделения многочисленной группы энтеробактерий после элективно-диагностических сред применяют дополнительные элективно-диагностические среды. Этими средами являются:

1. Среда Олькеницкого.

а) Соль Мора (0,2 г) и гипосульфат предварительно растворяют в дистиллированной воде в пробирках. Отдельно растворяют три углевода (лактозы, сахароза, глюкоза по 1 г) и мочевину (10 г) в колбе на водяной бане.

б) Все ингредиенты добавляют к расплавленному агару, размешивают и фильтруют через стерильную марлю, устанавливают рН 7,2-7,4, вносят индикатор (фиолетовый красный - 0,1 г, вода дистиллированная 25 мл), разливают в пробирки по 5-6 мл.

в) Стерилизуют при 0,5 атм 20 мин, охлаждают в скошенном положении, для получения столбика высотой 2,5 см и косяка - 4 см. Готовая среда бледно-розового цвета.

2. Среда Ресселя.

Среда предложена для определения у микробов ферментов, расщепляющих лактозу и глюкозу, с применением индикатора Андреде. Среда содержит МПА, к которому добавлены 2 % лактозы и 1 % глюкозы и 2 % реактива Андреде. Среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Разливают по пробиркам и скашивают, чтобы столбик был снизу, а сверху – косяк. Посев в среду проводят уколом в столбик и затем штрихом по косяку. Расщепление микробами только глюкозы окрашивает столбик среды. При расщеплении лактозы краснеет весь столбик и косяк, потому, что ее больше. В случае газообразования появляются пузырьки газа или разрыв среды. Применяют среду для дополнительной дифференциации бактерий кишечной группы.

2. Среда Клиглера.

Среда коммерческая, производства НИИИВС им. Мечникова (г.Петрово-Дальнее).

Дифференциально-диагностические среды.

1. Среды Хисса:

К 1 % пептонной воде добавляют 0,5 % раствор одного из углеводов (глюкоза, лактоза сорбит, маннит и пр.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в 1 н растворе NaOH). Среды разливают по пробиркам, содержащим поплавки (трубка 3 см с одним запаянным концом) для улавливания газообразования при разложении углеводов. Стерилизацию проводят текучим паром. Среды бесцветны, рН 7,2-7,4. При сбраживании углевода среда должна приобретать красный цвет.

2. Среда с мочевиной Кристенсена.

К 100 мл дистиллированной воды добавить пептон 0,1 г, хлорида натрия -0,5 г, калия динитрофосфата - 0,2 г, агара- 2 г, глюкозы- 0,1 г, фенолового красного 0,2 % - 0,6 мл, 10 мл 20 % мочевины.

Пептон, соль, агар растворить при нагревании, установить рН 6,8-6,9, профильтровать, стерилизовать при 115⁰ С текучим паром 1 ч, охладить до 50⁰ С. Раствор мочевины асептично добавить к основе. Среду разлить в пробирки, охладить и скосить. При положительном результате среда становиться красной, при отрицательном результате на уреазу - остается желтой.

3. Среды для определения декарбоксилаз, лизина, аргинина, орнитина.

К 40 мл мясной воды добавить 0,5 г пептона, глюкозы- 0,1 г, дистиллированной воды - 60 мл, 1 мл 1,6 % спиртового раствора бромтимолового синего, L-аминокислоты- 2 г или DL-аминокислоты, дрожжевого экстракта - 0,3 г. В воде растворить белковую питательную основу и глюкозу. Установить рН 6,0-6,1. Разделить среду на 4 равных части. В каждую из трех порций внести одну из перечисленных аминокислот, четвертая порция - контроль.

Среды кипятят 5-10 мин, установить вновь рН 6,0-6,1, прибавить индикатор и разлить в пробирки по 2- мл. Стерилизовать при 0,5 атм 15 мин. При расщеплении аминокислот цвет среды из желтой изменится в синий. В контроле - цвет желтый.

3. Среда Кларка.

а) Ингредиенты: пептон - 5,0 г

глюкоза - 5,0 г

калий фосфат двузамещенный - 5,0 г

б) Растворяют все ингредиенты в небольшом количестве дистиллированной воды (80-100 мл) при подогревании на водяной бане в течение 29-30 мин. Затем их охлаждают до 20⁰ С, фильтруют, доводят дистиллированной водой до 1000 мл, разливают в пробирки по 5 мл. Стерилизуют дробно текучим паром три дня подряд.

в) К суточной культуре на среде Кларка добавляют равный объем 20 % раствора едкого калия. Встряхивают и помещают в термостат при 37⁰ С в наклонном положении. Учет проводят через 3-4 ч и на следующий день. При положительной реакции верхний слой жидкости окрашивается в оранжево-розовый цвет. При отрицательном результате - окраска остается неизменной. С помощью метода определяется наличие у микробов ацетилметилкар-бинола-ацетоина.

Существует очень много других сред относящихся к элективным, дифференциально- диагностическим и др., которые невозможно привести в данном разделе.

Бактериологический контроль питательных сред

Все серии питательных сред, изготавливаемые промышленным или лабораторным способами, необходимо контролировать по нескольким основным свойствам:

1. заданные цвет, консистенция, влажность, прозрачность,

2. ростовые свойства - скорость роста бактерий на среде, воспроизводимость, пышность роста и пр.

3. элективность - воспроизводимый рост необходимых бактерий, при исключении роста остальных,

4. ингибирование - воспроизводимое отсутствие роста посторонней микрофлоры.

Питательные среды должны давать рост бактерий (количество колоний, размер их, цвет и пр.), в соответствии с культуральными свойствами. Контроль питательных сред должен проводится с помощью тест-систем - типовых или местных штаммов бактерий. Исходная взвесь тест-культуры для контроля составляет 1 млрд бактерий в 1 мл.

Чувствительность сред определяется максимальным посевным разведением культур из исходной взвеси, которое дает максимальный рост бактерий на всех чашках. Скорость роста устанавливается по минимальному времени инкубации посевов в часах, в течение которого обеспечивается формирование четких видимых невооруженым глазом колоний бактерий.

Методы стерилизации и дезинфекции

Стерилизация - необходимый набор методов не только в бактериологии. Стерилизация (лат. Sterilis - бесплодный) - это полное уничтожение всего живого (микроорганизмов и спор), т.е. обеспложивание.

Методы стерилизации.

1. Прокаливание на спиртовках и горелках бактериальных петель, игл, пинцетов и др. мелких металлических предметов.

2. Кипячение применяют для стерилизации хирургических инструментов, резиновых трубок, игл и пр. Кипячение не обеспечивает гибели спор некоторых бактерий.

3. Стерилизация сухим жаром. Применяют сухожаровые шкафы для обеспложивания стеклянной посуды, чашек Петри и пр. при 160⁰ С в течение 2 ч, при 170⁰ С в течение 40 мин. При этом методе погибает вегетативная микрофлора и споры некоторых бактерий.

4. Стерилизация паром под давлением. Применяют стерилизаторы (автоклавы), где действие на микробы оказывается паром под давлением. Этот метод достаточно эффективен. Основан на гидролизующем действии насыщенного пара. Стерилизуют питательные среды, жидкости, стеклянную посуду с резиновыми пробками, резиновые предметы и пр. Контроль режима стерилизации проводят с помощью химических термотестов и биотестов. Хемотест - это химический порошок, запаянный в ампулу, плавится при определенной температуре, окрашиваясь в определенный цвет. Биотесты - это полоски марли с нанесенными спорами определенных видов микробов, в определенной дозе. После стерилизации эти тесты сдают в баклабораторию и проводят высев на питательные среды. Отрицательный высев с биотеста свидетельствует о хорошем режиме стерилизации (таблица 10).

Таблица 10.

Соотношения показателей манометра и температуры кипения воды

показания манометра, кгс на 1 см2	температура кипения воды, град.	показания манометра, кгс на 1 см2	температура кипения воды, град.
0	100	0,7	116
0,2	105	0,8	117
0,4	110	1,0	121
0,5	112	1,5	127
0,6	114	2,0	134

5. Стерилизация текучим паром. Это обеспложивание объектов, разрушающихся при температуре выше 100⁰ С (молоко, желатин, картофель и пр.). Применяют паровой аппарат Коха или стерилизатор по 15-30 мин 3 дня подряд. Вегетативная микрофлора гибнет при первой стерилизации, а споры - при последующих.

6. Стерилизация УФЛ. Применяют для обеспложивания воздуха в боксах, блоках операционных и пр. ультрафиолетовое облучение. Длинна волны излучения бактерицидных ламп 253-265 нм.

7. Пастеризация. Обеззараживание пищевых продуктов. Споры не уничтожаются. Пастеризуют при 65-80⁰ С в течение 10-60 сек или мин в зависимости от свойств продукта.

8. Тиндализация. Дробное повторное обеззараживание при 60⁰ С по 1 ч 5-6 дней подряд легко разрушающихся объектов.

9. Стерилизация фильтрованием. Для этого применяют фильтры Зейтца с асбестовыми пластинами или свечи Шамберлана, имеющие глубинное или мембранное строение. Свечи глубинные состоят из волокнистых или гранулированных материалов (каолин с примесью песка и кварца). Для фильтров Беркфельда используют инфузорную землю. Диаметр пор в фильтрах 350-1200 нм, обозначенные буквами. Фильтры предварительно стерилизуют в паровом стерилизаторе при 120⁰ С.

Методы дезинфекции

Дезинфекция - это использование химических веществ для уничтожения возбудителей инфекционных заболеваний во внешней среде. Дезинфекция (лат. Infectia -инфекция, франц. des - отрицательная приставка) отличается от стерилизации действием на вегетативную микрофлору.

Средства, применяемые для дезинфекции должны обладать определенными свойствами:

1. хорошо растворяться в воде,

2. дезинфицировать объекты, несмотря на примеси органических веществ в материале,

3. в короткие сроки проявлять бактерицидные свойства,

4. не оказывать на животных и людей токсическое действие,

5. не портить обеззараживаемые объекты,

6. хранить дезинфекционные свойства определенные сроки,

7. быть дешевыми и удобными в применении и транспортировке.

Дезинфицирующие вещества имеют разные механизмы действия и предназначены для обработки разнообразных объектов. В последнее десятилетие для целей дезинфекции разрешены к применению (примеры):

1. АОХ-К (активные окислы хлора концентрированные) - применяют в ЛПУ и детских учреждениях при инфекциях бактериальной и вирусной этиологии, включая туберкулез.

2. ЛИЗОФОР-МИН 3000 (германия). Проводят дезинфекции изделий медицинского назначения при бактериальных и вирусных инфекциях.

3. ПФК-1 (пероксогидрат фторида калия). Применяют с целью профилактической, заключительной и текущей дезинфекции при заболеваниях вирусной и бактериальной этиологии.

4. КЛОРСЕПТ-17. Применяют для дезинфекции помещений, лабораторной посуды и белья, при инфекциях, включая туберкулез.

5. Аква-Бор (концентрат многоатомных спиртов). Применяют для дезинфекции белья, помещений при заболеваниях грибковой и бактериальной этиологии.

6. Хлорамин, 0,5 % раствор. Для дезинфекции рук медперсонала, 2 мин.

7. Хлорамин, 1 % раствор Для орошения и протирания санитарного транспорта.

Дезинфекционные работы и обработка рук персонала регламентированы отраслевыми и государственным стандартами, инструктивно-методическим материалом, учитывающим все виды проведения дезинфекционных работ. Также регламентированы методы и способы проведения асептики и антисептики.