Реферат тема: Электрофорез
Аркадан Дарин
3 группа 3 курс
Электрофорез— это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.
С помощью электрофореза удаётся покрывать мелкими частицами поверхность, обеспечивая глубокое проникновение в углубления и поры. Различают две разновидности электрофореза: катафорез — когда обрабатываемая поверхность имеет отрицательный электрический заряд (то есть подключена к отрицательному контакту источника тока) и анафорез — когда заряд поверхности положительный.Электрофорез является одним из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии.
Электрофорез в научных исследованиях
В биохимии и молекулярной биологии электрофорез используется для разделения макромолекул — белков и нуклеиновых кислот (а также их фрагментов). Различают множество разновидностей этого метода (см. статью Электрофорез белков). Этот метод находит широчайшее применение для разделения смесей биомолекул на фракции или индивидуальные вещества и используется в биохимии, молекулярной биологии, клинической диагностике, популяционной биологии (для изучения генетической изменчивости) и др.
Электрофорез белков — способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки. Электрофорез белков применяют как для анализа компонентов смеси белков, так и для получения гомогенного белка. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков, является электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли.
Варианты метода электрофореза белков
Существует множество разновидностей и модификаций данного метода, которые используются (или использовались в определённые периоды развития биохимии) в различных областях:
Электрофорез в свободных средах (без поддерживающей среды)
Электрофорез с подвижной границей
Зональный электрофорез без поддерживающей среды
Капиллярный электрофорез
Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой
Электрофорез на фильтровальной бумаге
Электрофорез белков на ацетат-целлюлозной мембране
Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды
Электрофорез белков в ПААГ
Электрофроез белков в крахмальном геле
Электрофорез белков в агарозном геле
Электрофорез белков подразделяется также на одномерный и двумерный (2D-) электрофорез, препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков и электрофорез в присутствии детергента (в денатурирующих условиях). Разновидностью метода электрофореза являются изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез.
В случае использования иммунологических методов для выявления разделённых белков говорят про иммуноэлектрофорез.
Иммуноэлектрофорез. Суть метода заключается в следующем:
- проводят электрофоретическое разделение белков вгеле;
- по окончанииэлектрофореза в еле параллельно направлению электрофореза вырезают бороздки;
- в бороздки вносят антитела (антисыворотку), например к тяжелым (альфа, дельта, эпсилон, гамма, мю) или легким (лямбда, каппа) цепям иммуноглобулинов. Эти антитела и разделенные при электрофорезе белки диффундируют навстречу друг другу. В тех местах, где антитела связываются с белками, образуются дуги преципитации
Иммуноэлектрофорез позволяет оценить лишь качественный состав исследуемой смеси белков. Оценка результатов исследования требует высокой квалификации. Чаще всего этот метод применяется для выявления и характеристики моноклональных антител.
Электрофорез с иммунофиксацией. Этот метод основан на электрофоретическом разделении белков сыворотки в геле с последующей инкубацией геля в присутствии антител к тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов. При связывании белков с антителами образуются иммунные комплексы, которые можно увидеть после окрашивания. Иммунные комплексы, содержащие нормальные иммуноглобулины, откладываются в виде широкой, размытой полосы, моноклональные - в виде более узкой и четко очерченной. Этот метод также является качественным, однако более чувствителен и прост, чем иммуноэлектрофорез. Электрофорез с иммуно- фиксацией часто применяется в сочетании с иммуноэлектрофорезом для определения моноклональных или олигоклональных иммуноглобулинов.
Зональный электрофорез - полуколичественный метод, позволяющий разделить смесь белков в зависимости от их молекулярной массы и электрического заряда. Суть метода заключается в следующем: исследуемую смесь белков на носителе (например, пластине с гелем) помещают в камеру для электрофореза, заполненную буферным раствором и подключенную к источнику постоянного тока. При электрофорезе белков сыворотки обычно получается 5 основных полос, которые соответствуют фракциям альбумина, альфа1-, альфа2-, бета- и гамма-глобулинов. Иммуноглобулины мигрируют преимущественно во фракцию гамма-глобулинов, хотя также присутствуют во фракциях бета- и альфа2-глобулинов. Относительное содержание каждой фракции сывороточных белков можно оценить с помощью денситометра.
С помощью зонального электрофореза можно исследовать не только сыворотку, но и другие биологические жидкости, например СМЖ и мочу. Этот метод позволяет оценить белковый состав исследуемой пробы и выявить моноклональные антитела, хотя он недостаточно чувствителен для определения моноклональных антител в низкой концентрации на ранних стадиях миеломной болезни.
Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.
К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель (например, динитрофенол, бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс.
Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис и борную кислоту TAE и TBE. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК под действием приложенного электрического поля.
После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.
Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, «линейка»), содержащий линейные фрагменты ДНК известной длины.
Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.
Электрофорез в медицине (физиотерапии)
Лечебное вещество наносится на прокладки электродов и под действием электрического поля проникает в организм через кожные покровы (в терапии, неврологии, травматологии и др.) или слизистые оболочки (в стоматологии, ЛОР, гинекологии и др.) и влияет на физиологические и патологические процессы непосредственно в месте введения. Электрический ток также оказывает нервно-рефлекторное и гуморальное действие.
Преимущества лечебного электрофореза:
введение малых, но достаточно эффективных доз действующего вещества;
накопление вещества и создание депо, пролонгированность действия;
введение в наиболее химически активной форме — в виде ионов;
возможность создания высокой местной концентрации действующего вещества без насыщения им лимфы, крови и других сред организма;
возможность введения вещества непосредственно в очаги воспаления, блокированные в результате нарушения локальной микроциркуляции;
лечебное вещество не разрушается, как например, при введении per os;
слабый электрический ток благоприятно влияет на реактивность и иммунобиологический статус тканей.
Противопоказания к проведению электрофореза: острые гнойные воспалительные заболевания, СН II—III степени, ГБ III стадии, лихорадка, тяжелая форма бронхиальной астмы, дерматит или нарушение целостности кожи в местах наложения электродов, злокачественные новообразования. Учитываются противопоказания для лечебного вещества. Вещества, используемые при электрофорезе, по способу введения разделяются на:
отрицательно заряженные, вводимые с отрицательного полюса — катода (бромиды, йодиды, никотиновая кислота и другие);
положительно заряженные, вводимые с положительного полюса — анода (ионы металлов — магний, калия, кальция);
вводимые как с анода, так и с катода (гумизоль, бишофит и другие).
Преимущество бишофита — в биполярном введении, так как эффект оказывают одновременно и положительно, и отрицательно заряженные ионы. При назначении семейным врачом лечебного электрофореза при направлении в отделение медицинской реабилитации целесообразно указывать: диагноз, название метода (электрофорез), желаемое лечебное вещество и зоны его воздействия. Физиотерапевт определяет полярность, силу тока, продолжительность в минутах, кратность процедур.
Камера для горизонтального электрофореза серии S-N- идеально подходит для разделения нуклеиновых кислот в погружаемом агарозном геле.
Камера S-2N состоит из корпуса выполненного в виде ванночки(камеры) со стационарно закрепленными платиновыми электродами, каждый из которых соединен на корпусе камеры со своим разъемом, маркированным цветной накладкой (красной или черной), и съемной прозрачной крышки с закреплёнными на ней ответными частями камерных разъемов. Корпус изготовлен методом литья из прозрачного полистирола, что обеспечивает долговечность и безопасность использования камеры. Конструкция крышки обеспечивает автоматическое обесточивание камеры при ее снятии. Подключение камеры к блоку питания осуществляется при помощи сетевых разъемов, закрепленных на свободных концах разноцветных шнуров, берущих начало на ответных частях камерных разъемов на крышке камеры. Положительный вывод блока питания подключается к сетевому разъему, маркированному красным цветом. Отрицательный вывод подключается к разъему, маркированному черным цветом. Для удобства пользователей камеры укомплектована заливочным устройством, с прижимными винтами.
Конструкция гелевой рамки S-2N позволяет устанавливать от 1 до 5 гребенок на гель.
Камера для горизонтального электрофореза S-2N (размер геля 170х120 мм). Конструкция съемной прозрачной крышки обеспечивает автоматическое обесточивание камеры при ее снятии. Камера SE-хорошо подходит для анализа большого количества образцов (18-120).
Технические характеристики
Габаритные размеры 334х196х100мм
Рабочий объем буфера 500мл
Размер геля 170х120мм
Общий вес 700 гр
Максимальное напряжение 250 В
Максимальный ток 150мА
Максимальная мощность не более 20 Вт
Комплектация:
Камера с вмонтированными электродами 1шт
Крышка камеры с разноцветными шнурами 1шт
Столик заливочный SE-2-CT 1шт
Рамка гелевая SE-2-F5 1шт
Держатель гребенок SE- 2-CB 2шт
гребенка ( оргстекло 1 мм, 18 зубцов) SE-2-C181.0 2шт
Рекомендации по эксплуатации:
При проведении электрофореза следите за тем, чтобы температура буферного раствора не превышала 45 градусов
Не допускается падение составляющих прибора с высоты более 100мм
Желательно менять буфер после 2-3 электрофорезов
Не допускается контакт составных частей изделия с органическими растворителями
При подключении к блоку питания соблюдать полярность!
Перед заливкой геля в заливочное устройство дайте остыть раствору агарозы до 60 градусов
Прибор горизонтального электрофореза ЕС 12-13
Приборы для горизонтального электрофореза серии ЕС предназначены для разделения биомолекул в агарозном геле под действием электрического поля, включая разделение продуктов ПЦР.
Две модели, позволяющие формировать гели размером 12х13 см и 8х13 см
Электрофоретическая камера изготовлена из органического стекла и снабжена двумя съемными электродами из электрохимически нейтрального сплава
Конструкция столика для геля позволяет установить от 1 до 7 гребенок.
Конструкция камеры позволяет стандартизировать постоянно повторяющиеся операции по заливке геля и проведению электрофореза
Электронная схема отключения предусматривает автоматическое обесточивание камеры при снятии крышки.
Прибор горизонтального электрофореза ЕС 12-13 Технические характеристики:
Название ЕС 12-13
Объем электродного буфера не более, мл 400
Размер разделяющего геля, мм 120x130
Внешние габариты, мм 240x225x80
Внутренние габариты, мм 180x135x30
Количество гребенок:
на 12 зубцов 2
на 18 зубцов 4
Размер гребенок
Ширина зубцов, мм 3
Толщина зубцов, мм 1,5
Предельно допустимое рабочее напряжение, В 300
Предельно допустимый разогрев прибора при работе,ºС 50
Длина разгона, мм 35 - 130
Масса, кг 1