23. Репликация геномов рнк-содержащих вирусов
Репликация РНК-геномов требует активности РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая у большинства организмов не кодируется геномом клетки хозяина, и соответственно должна обеспечиваться вирусом. В течение процесса репликации РНК генома вируса, как и при всех других процессах синтеза нуклеиновых кислот, цепь матрицы считывается полимеразой в направлении 3′ → 5′, тогда как вновь синтезируемая нить начинается с 5′-нуклеотида и синтезируется по направлению к 3′-концу.
РНК-зависимые РНК-полимеразы, кодируемые вирусом, должны транспортироваться в клетку либо одновременно с вирусной частицей, либо синтезироваться вскоре после заражения.
Особенностью многих РНК-содержащих вирусов является то, что их геном состоит из множественных сегментов. У ДНК-содержащих вирусов сегментация генома наблюдается крайне редко. В течение процесса репликации, молекула РНК остается линейной, и ковалентно замкнутые в кольцо молекулы не наблюдаются никогда.
Все ферменты, которые принимают участие в синтезе РНК, будь то РНК вируса или клетки-хозяина, не способны к так называемому пруфридингу, то есть к исправлению ошибок при неправильно спарившихся основаниях. В то же время при синтезе ДНК такая проверка происходит. Отсутствие пруфридинга означает, что РНК-геномы мутируют гораздо легче, чем ДНК-геномы. По этой причине эволюция РНК-содержащих вирусов происходит намного быстрее, чем эволюция ДНК-содержащих вирусов. Высокая вероятность мутаций также накладывает ограничения на размер РНК-генома, поскольку при его увеличении увеличивается вероятность мутаций в критических частях генома.
Для синтеза точной копии генома, РНК-зависимые РНК-полимеразы должны начинать синтез с 3′-терминального нуклеотида матричной цепи. Поэтому 3′-конец должен содержать сигнал инициации синтеза.
Все вирусы с РНК-геномами должны реплицироваться через промежуточную двухцепочечную РНК. Вирусы с одноцепочечной геномной РНК должен образовывать двухцепочечный промежуточный продукт посредством синтеза комплементарной «антигеномной» цепи РНК. Эта «антигеномная» цепь, в свою очередь, должна быть использована как матрица для синтеза дочерних геномов, которые будут упакованы в вирусные частицы. Как и с исходной цепью, синтез должен начинаться с терминального 3′-нуклеотида, чтобы синтезировать геном полной длины. Таким образом, эта «антигеномная» цепь РНК также должна содержать сигнал начала синтеза для полимеразы. Для большинства вирусов механизм инициации синтеза РНК плохо понятен; только в отдельных случаях выявлены предположительные регуляторные элементы на концах РНК, которые направляют синтез дочерних РНК.
24. Репликация вироидов
Вироиды — патогены растений, которые состоят из короткого фрагмента (несколько сотен нуклеотидов)высококомплементарной, кольцевой, одноцепочечной РНК, не покрытой белковой оболочкой, характерной для вирусов.
Геном вироидов представлен ковалентно замкнутой в кольцо одноцепочечной РНК. Эта РНК, в отличие от вирусов, не кодирует никаких белков, поэтому для вироидов нельзя отнести геномную или комплементарную ей РНК к (+) или (–) типу. Однако та РНК, которая присутствует в клетке в наибольшем количестве, по соглашению условно названа (+)-смысловая РНК, хотя такая терминология в случае вироидов является условной и не имеет общепринятого значения.
РНК вироидов не входит в состав вирионов какого-либо типа и всегда является обнаженной. Когда эта РНК попадает в клетку, она реплицируется белками клетки-хозяина. Ферментом, который осуществляет репликацию вироидов, наиболее вероятно является ДНК-зависимая РНК-полимераза. Остается неизвестным, каким образом этот фермент функционирует на РНК-матрице, но это может по крайней мере отчасти быть связано со структурой генома вироидов, значительная часть которого имеет спаренные нуклеотиды.
25.
Вирионы всех ретровирусов содержат две идентичные молекулы одноцепочечной геномной РНК, которые связаны одна с другой. Эти РНК имеют последовательность с (+) смыслом, также они имеют характерные особенности мРНК эукариот, такие как кэп на 5′-конце и полиА хвост на 3′-конце. Не смотря на это, геномные РНК никогда не транслируются после попадания вируса в клетку. Вместо этого, они используются как матрицы для синтеза двухцепочечных молекул ДНК. Этот процесс, называемый обратной транскрипцией, происходит в цитоплазме внутри вирусной частицы.
Обратная транскриптаза обладает тремя ферментативными активностями. Во-первых, она осуществляет обратную транскрипцию, то есть синтез ДНК на матрице РНК. Во-вторых, она является ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, то есть синтезирует ДНК на ДНК-матрице. В третьих, она является РНКазой Н, расщепляя нить РНК в гибриде РНК:ДНК.
Обратная транскриптаза требует РНК-праймера. Ретровирусы в качестве праймера используют транспортную РНК хозяина. Эта тРНК связывается посредством спаривания оснований с геномной РНК вируса вблизи 5′-конца. Каждый ретровирус содержит специфический тип тРНК, например вирус саркомы Рауса имеет триптофановую тРНК, вирус лейкемии мышей содержит пролиновую тРНК, а ВИЧ – лизиновую тРНК. Обратная транскриптаза попадает в клетку вместе с вирионом. Обратная транскрипция протекает без полного раздевания вирусного генома. Это объясняет в частности факт, что, несмотря на то, что вирусный геном имеет все особенности мРНК, он никогда не транслируется: рибосомы хозяина попросту не имеют к нему доступа.
26.
Некоторое количество вирионов, которые были сформированы у зараженного хозяина, должны быть перенесены на новых хозяев, в которых образуются новые вирионы; в противном случае вирус исчезнет. Единственной альтернативной возможностью для выживания генов вируса является его сохранение в клетках в виде нуклеиновой кислоты, которая реплицируется и передается дочерним клеткам при делении.
Вирусы микроорганизмов высвобождаются из зараженных клеток в окружающую среду, где могут присутствовать другие восприимчивые клетки.
Вирусы многоклеточных организмов также должны найти новую клетку для заражения. Инфекция может распространяться к примыкающим клеткам, или к клеткам, находящимся на удалении от зараженной, посредством переноса вирусных частиц кровью у животных или по флоэме растений. Однако в конечном итоге для своего выживания вирус должен найти нового хозяина.
Передача вирусов потомству при любых способах размножения называется вертикальной передачей вирусов. Все другие случаи передачи вирусов называют горизонтальной передачей.
Распространение вирусов в человеческой популяции имеет свои особенности. Выделяют несколько механизмов передачи вирусов:
Трансмиссивный механизм — передача с помощью переносчиков.
Парентеральный механизм — передача вирусов через кровь. Алиментарный (энтеральный) механизм — вирус проникает через слизистые оболочки органов пищеварения.
Аэрогенный механизм — входными воротами инфекции являются слизистые органов дыхания. Реализуется воздушно-капельным или пылевым путем.
Контактный механизм — реализуется через кожные покровы. Вертикальный механизм — передача вирусов от матери плоду во время вынашивания и родов. Возбудитель может передаваться через плаценту, через околоплодные воды и оболочки, при прохождении плода через родовые пути матери.
При трансмиссивной передаче переносчик часто называют вектором (от лат. vector - несущий), а трансмиссивную передачу вирусов – передачей с помощью векторов.
Многие векторы вирусов позвоночных животных являются членистоногими, или артроподами (насекомые, клещи). Поэтому переносимые членистоногими вирусы позвоночных часто называют арбовирусами (от arthropod-borne viruses).
Вектор приобретает вирус, когда он питается на зараженном хозяине, и в дальнейшем переносит вирус на одного или нескольких новых хозяев. Некоторые вирусы переносятся после того, как вирионы прикрепляются к ротовому аппарату их векторов в результате питания. Передача вирусов в таком случае может осуществляться в течение секунд или минут после того, как вектор приобрел вирус.
Многие переносимые векторами вирусы проходят через стенки пищеварительного тракта вектора и попадают в его кровеносную систему. Далее вирус попадает в слюнные железы и выделяется со слюной, заражая нового хозяина при питании вектора. Такой способ передачи вирусов называют циркулятивным, и передача вируса вектором может происходить только спустя часы или даже дни после того, как он приобрел вирус.
Некоторые циркулятивные вирусы реплицируются в одной или нескольких тканях и органах своего вектора; таким образом, есть вирусы, которые могут реплицироваться как в беспозвоночных животных, так и в растениях, или как в беспозвоночных, так и в позвоночных животных.
У векторов некоторые вирусы передаются при спаривании от самцов к самкам и наоборот; другие вирусы передаются следующему поколению через яйца. В случае передачи через яйца, это явление называют трансовариальной передачей вируса.
27.
Транскрипция (от лат. transcriptio — переписывание) — процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы; перенос генетический информации с ДНК на РНК.
Факторы транскрипции (транскрипционный факторы) — белки, контролирующие перенос информации с молекулы ДНК в структуру мРНК (транскрипцию) путем связывания со специфичными участками ДНК. Факторы транскрипции выполняют свою функцию либо самостоятельно, либо в комплексе с другими белками. Они обеспечивают снижение (репрессоры) или повышение (активаторы) константы связывания РНК-полимеразы с регуляторными последовательностями регулируемого гена.
Транскрипция инициируется, когда факторы транскрипции связываются с последовательностями в пределах промоторов и энхансеров. Первичный транскрипт кэпируется на 5′-конце и полиаденируется на 3′-конце. мРНК образуется после удаления интронов из первичного транскрипта.
В вирусных и клеточных системах молекулярные механизмы транскрипции принципиально сходны. Отличие заключается в существовании различных способов регуляции транскрипции вирусных геномов. Необходимость такой регуляции определяется разной потребностью в вирусоспецифических белках. Структурные белки, как правило, требуются в больших количествах, чем белки-ферменты. Кроме того, на ранних стадиях инфекции нужны белки, обеспечивающие репликацию вирусного генома, а на поздних — структурные белки. Поэтому целесообразно, чтобы разные вирусные гены считывались с разной эффективностью, и эта эффективность менялась во времени. Процесс транскрипции регулируется на уровне транскриптона (оперона) за счет работы репрессоров и активаторов белковой природы и энхансеров (усилителей), которые представляют собой определенные короткие последовательности геномной нуклеиновой кислоты. Транскрипция регулируется количественно и качественно и осуществляется как клеточными, так и вирус-специфическими механізмами. У вирусов установлено существование целого ряда способов регуляции транскрипции. Временной тип регуляции. У ДНК-содержащих вирусов существует три периода транскрипции: сверхранний, ранний и поздний. При сверхранней и ранней транскрипции считываются сверхранние и ранние гены, при поздней — поздние гены. Количество транскриптов поздних генов превышает количество ранних. Многие сверхранние мРНК являются генами NS белков-ферментов и регуляторов транскрипции и репликации. Поздние мРНК являются генами структурных белков. Фактором регуляции транскрипции у ядерных вирусов является транспорт мРНК в цитоплазму. Каскадный тип регуляции транскрипции генов. Суть такой регуляции заключается в том, что продукты сверхранней транскрипции, например α-белки, необходимы для транскрипции другой группы генов, кодирующих β-белки, которые, в свою очередь, включают транскрипцию следующей группы генов — γ-белков. Полярный тип регуляции определяется порядком расположения генов в геноме. Количество синтезируемых молекул полипептида зависит от расстояния между геном и промотором. Вдоль генома (-)РНК вирусов существует как бы градиент эффективности транскрипции. Чаще транскрибируются гены 3'-региона, реже — гены 5'-конца. Взаимное расположение и сила регуляторных сигналов. Считывание или несчитывание транскрибируемого участка матрицы зависит от свойств и расположения регуляторных сигналов — промоторов (обеспечивают начало транскрипции) и терминаторов (обеспечивают прекращение транскрипции). Основа регуляции — взаимное расположение регуляторных сигналов и их сила. Активность сигналов может меняться во времени. Характер образования транскриптов и способ регуляции зависят от того, имеем ли мы дело с вирусами прокариот или эукариот. Напомним, что в клетках прокариот возможна множественная инициация трансляции на полицистронной матрице, тогда как в клетках эукариот на РНК реализуется только одна точка инициации трансляции и эта мРНК функционально моноцистронна. Ограничения, накладываемые клеткой хозяина, в первую очередь сказываются на механизмах транскрипции и посттранскрипционного созревания мРНК. Приведем конкретные примеры способов регуляции транскрипции вирусных геномов в клетках прокариот и эукариот. Самый простой способ регуляции транскрипции в клетках прокариот установлен у фагов 1М13 и fd, где разная степень экспрессии фаговых генов регулируется за счет расположения и силы промоторов. За счет наличия «сильных» промоторов активно транскрибируются гены, кодирующие основной структурный белок капсида и ДНК-связывающий белок. В то же время, геномная последовательность, кодирующая минорные вирусные белки, имеет промоторы, отнесенные к разряду «слабых». Более сложная регуляция транскрипции генов наблюдается у фага λ, имеющего, как минимум, три типа регуляции транскрипции: 1) ретро-регуляция — осуществляется при участии нуклеотидных последовательностей, расположенных за транскрибируемым геном. Этот участок комплементарен предшествующему участку гена и в образовавшемся транскрипте возникает внутримолекулярная двухнитевая структура, которая впоследствии разрушается РНКазой III; 2) аутогенная регуляция — регуляция активности гена при помощи продукта этого же гена; 3) индукция профага — наблюдается в результате инактивации репрессора. Для бактериофагов показана реализация временного типа регуляции транскрипции, что связано с существованием ранних, средних и поздних генов и соответствующих им промоторов. Так, у фага Т4 структура ранних промоторов близка к таковой промоторов клетки хозяина и именно они сразу узнаются клеточной РНК-полимеразой. Последующая активация средних генов связана с фагоспецифическим белком — продуктом трансляции раннего гена. Система регуляции транскрипции генов фага Т4 включает еще один уникальный механизм — ковалентную и нековалентную модификацию РНК-полимеразы, способствующую узнаванию ею поздних промоторов. Модифицированная РНК-полимераза перестает узнавать промоторы ранних генов. Еще один способ временной регуляции наблюдается у фага Т7. Суть этого способа заключается в том, что одним из продуктов ранних генов, транскрибированных клеточной РНК-полимеразой, является фаговая РНК-полимераза, которая узнает уже другой набор промоторов и транскрибирует поздние гены. Регуляция транскрипции вирусных геномов в эукариотических клетках осуществляется с помощью более сложных механизмов. Кроме промоторов и терминаторов транскрипционная система дополняется новыми регуляторными элементами — энхансерами (усилители), а также и разнообразными способами процессинга первичных транскриптов. В данном разделе мы не станем останавливаться на конкретных способах регуляции транскрипции генов вирусов эукариот, которые, в общих чертах, сходны с перечисленными выше. Как дополнение, рассмотрим процессинг первичных транскриптов на примере ядерного вируса эукариот — аденовируса. Процессинг — это посттранскрипционные изменения первичных транскриптов или созревание мРНК, включающее кэпирование 5'-конца, полиаденилирование 3'-конца и сплайсинг. У аденовируса лишь кэпирование идет эффективно на разных стадиях репродукции и происходит до завершения синтеза транскрипта. Большой вклад в регуляцию экспрессии аденовирусного генома вносит альтернативное полиаденилирование. Особенно наглядно это видно при образовании поздних мРНК. В первичном транскрипте поздней области генов есть 5 участков, несущих сигнал полиаденилирования (гексануклеотид AAUAAA). Полиаденилирование может произойти в любом участке и из первичного транскрипта может образоваться только одна из 5-ти возможных классов мРНК. От выбора того или иного участка полиаденилирования зависит относительная концентрация той или иной мРНК. Подавляющее большинство кэпированных и полиаденилированных транскриптов аденовирусного генома подвергается альтернативному сплайсингу — удалению различных участков первичного транскрипта, что осуществляется при помощи клеточных механизмов. Наличие альтернативного сплайсинга и альтернативного полиаденилирования при процессинге первичных транскриптов вирусов эукариот определяется моноцистронностью эукариотических мРНК.
28.
При кэпировании происходит присоединение к 5'-концу транскрипта 7-метилгуанозина посредством трифосфатного моста, а также метилирование рибоз двух первых нуклеотидов.
Кэп, как полагают, выполняет следующие функции:
- помогает транспорту мРНК из ядра в цитоплазму;
- защищает мРНК от разрушения экзонуклеазами;
- требуется для инициации трансляции.
Клеточные ферменты, которые обладают активностью кэпирования, являются гуанилил-трансферазами и метилтрансферазами. Эти ферменты располагаются в ядре, и большинство вирусов, у которых транскрипция осуществляется в ядре, используют ферменты клетки. Многие вирусы, которые реплицируются в цитоплазме, кодируют свои собственные ферменты кэпирования и метилирования. В число этих вирусов входят поксвирусы, реовирусы и коронавирусы. Вирусы, имеющие (–)РНК и сегментированный геном, выработали механизм «срывания» кэпа с клеточных мРНК. В число этих вирусов входят вирусы животных, такие как вирус гриппа, и вирусы растений, такие как вирус бронзовости томатов. При таком «срывании шапки» комплекс вирусных белков, составляющих вирусную РНК-полимеразу, связывается с кэпированными клеточными мРНК. Этот комплекс обладает эндонуклеазной активностью, благодаря которой клеточная мРНК расщепляется, обычно через 10–20 нуклеотидов от 5′-конца. Не все вирусные РНК являются кэпироваными; их трансляция инициируется механизмами, которые не зависят от кэпа.
На 3′-конце первичных транскриптов эукариот и их вирусов имеется ряд остатков аденозина, так называемый полиадениловый хвост. Полиаденилирование вероятно увеличивает стабильность мРНК и играет роль в инициации трансляции. Однако ряд вирусов, например реовирусы, не полиаденируют свои мРНК. В большинстве случаев сигнал полиаденилирования расположен на 10–30 оснований выше сайта полиаденилирования. Впервые сигнал полиаденилирования ААТААА был выявлен у вируса SV40 в 1981 году. В большинстве случае полиаденирование протекает сходным образом. В течение транскрипции РНК-полимераза перемещается вдоль матрицы и проходит через сигнал полиаденирования и сайт полиаденирования. Синтезированная РНК далее расщепляется в сайте полиаденилирования, и полиадениловый хвост добавляется пошаговым добавлением остатков адениловой кислоты (АМФ). Это добавление осуществляет комплекс ферментов, называемый поли(А)-полимераза. Некоторые вирусы, однако, имеют свой собственный механизм полиаденилирования мРНК.
29.
Сплайсинг (от англ. splice — сращивать или склеивать концы чего-либо) — процесс вырезания определенных нуклеотидных последовательностей из молекул РНК и соединения последовательностей, сохраняющихся в «зрелой» молекуле, в ходе процессинга РНК. Наиболее часто этот процесс встречается при созревании информационной РНК (мРНК) у эукариот, при этом путём биохимических реакций с участием РНК и белков из мРНК удаляются участки, не кодирующие белок (интроны) и соединяются друг с другом кодирующие аминокислотную последовательность участки — экзоны. Альтернативный сплайсинг — процесс, в ходе которого экзоны, вырезаемые из пре-мРНК, объединяются в различных комбинациях, что порождает различные формы зрелой мРНК. В результате один ген может порождать не одну, а множество форм белка. Для некоторых описаны альтернативные пути сплайсинга и полиаденилирования одного и того жетранскрипта. Экзон одного варианта сплайсинга может оказаться интроном в альтернативном пути. Поэтому молекулы мРНК, образованные в результате альтернативногосплайсинга, различаются набором экзонов. Это приводит к образованию разных мРНК, и соответственно, разных белков одного первичного транскрипта. Разные варианты сплайсинга могут приводить к образованию разных изоформ одного и того же белка. Например, ген тропонина состоит из 18 экзонов и кодирует многочисленныеизоформы этого мышечного белка. Разные изоформытропонина образуются в разных тканях и на определенных стадиях их развития.
Пре-мРНК некоторых генов эукариот могут подвергаться альтернативномусплайсингу. При этом интроны в составе пре-мРНК вырезаются в разных альтернативных комбинациях. Разные варианты альтернативного сплайсинга одной пре-мРНК могут осуществляться в разные периоды развития организма или в разных тканях, а также у разных особей одного вида. Как правило, при альтернативномсплайсинге из первичного транскрипта удаляются и некоторые экзоны.
Существует несколько механизмов альтернативногосплайсинга:
Экзон может вырезаться или оставаться в составе мРНК.
Один из двух «взаимоисключающих» экзонов вырезается, а другой остаётся.
Использование альтернативного донорных сайтов: используются разные 5'-точки разрезания первичного транскрипта (донорные сайты), что изменяет 3'-границу вышележащего (upstream) экзона
Использование альтернативных акцепторных сайтов: используются разные 3'-точки разрезания транскрипта (акцепторные сайты), так что меняется 5'-границы нижележащего (downstream) экзона.
Сохранение интронов в составе мРНК. В этом случае для сохранения функциональности белка интрон должен содержать последовательность нуклеотидов, не вызывающуюсдвиг рамки считывания и не содержащую стоп-кодонов.
Существуют и другие механизмы альтернативногосплайсинга.
Некоторые из продуктов альтернативного сплайсинга пре-мРНК нефункциональны (такой вариант альтернативного сплайсинга осуществляется у дрозофилы при определении пола), но нередко в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК одного гена образуются многочисленные мРНК и их белковые продукты.
Показано, что у человека 94 % генов подвержено альтернативномусплайсингу (у остальных 6 % генов нет интронов). Геном круглого червя Caenorhabditiselegans по количеству генов практически не отличается от генома человека, однако альтернативному сплайсингу подвергаются пре-мРНК только 15 % генов. Таким образом, альтернативныйсплайсинг позволяет увеличить разнообразие белковых продуктов генов, сохраняя при этом относительно небольшое количество различных генов в геноме и не создавая избыточных копий генов.
Разные варианты сплайсинга могут приводить к образованию разныхизоформ одного и того же белка. Например, ген тропонина состоит из 18 экзонов и кодирует многочисленныеизоформы этого мышечного белка. Разные изоформытропонина образуются в разных тканях на определённых стадиях их развития.
30. Процесс трансляции разделяют на
инициацию — узнавание рибосомой стартового кодона и начало синтеза.
элонгацию — собственно синтез белка.
терминацию — узнавание терминирующего кодона (стоп-кодона) и отделение продукта.
Инициация. У эукариот существуют два механизма нахождения рибосомой стартового AUG: кэп-зависимый (сканирующий) и кэп-независимый (внутренняя инициация).
При сканирующем механизме рибосома (точнее, её малая субъединица) садится на 5'-конец мРНК в области кэпа и двигается вдоль молекулы мРНК, «сканируя» один кодон за другим, пока не наткнётся на инициаторный AUG. Для привлечения рибосомы к 5'-концу мРНК требуется специальная структура, кэп — 7-метилгуанин, прикреплённый к 5'-концевому нуклеотиду мРНК.
При механизме внутренней инициации, называемом у эукариот также IRES-зависимым механизмом, рибосома садится на внутренний участок мРНК, называемый IRES (от англ. Internal Ribosomal Entry Site, участок внутренней посадки рибосомы) — участок мРНК, обладающий выраженной вторичной структурой, позволяющей ему направлять рибосомы на стартовый AUG. По IRES-зависимому механизму инициируется синтез лишь на небольшой части клеточных мРНК, а также на РНК некоторых вирусов .
Также у эукариот возможна реинициация трансляции, когда после окончания трансляции рибосома с белковыми факторами не диссоциирует от мРНК, а перескакивает с 3' на 5' конец мРНК и начинает инициацию ещё раз. Такое возможно благодаря замкнутой кольцевой форме мРНК в цитоплазме.
(У эукариот рибосомная 40S частица, несущая ряд факторов инициации и метионил-тРНКр, связывается преимущественно с 5'-концом цепи мРНК (как правило, кэпирован-ным), а затем скользит по цепи в направлении к 3'-концу без трансляции, потребляя АТФ, пока не натолкнется на триплет AUG, спаривающийся с антикодоном тРНКр и служащий инициаторным кодовом.)
31.
По месту своей репродукции (ядро или цитоплазма) вирусы разделяют на ядерные и цитоплазматические. Сборка вирионов цитоплазматических вирусов происходит в разных компартментах цитоплазмы. Так, поксвирусы созревают в районе цитоплазмы, лишенном мембранных структур, флавивирусы — в аппарате Гольджи, реовирусы — в каналах ЭПР, многие вирусы растений формируют вирионы в хлоропластах. Процесс созревания ВЧ включает несколько этапов: формирование капсида, упаковку нуклеиновых кислот, приобретение оболочки. Общие принципы формирования вирусных частиц мы представим на нескольких примерах.
Пример 1. Самым простым примером вирусного морфогенеза является образование РНП. В этом случае сборка белковой оболочки происходит одновременно с включением геномной РНК в состав нуклеокапсида. Субъединицы, представленные идентичными полипептидными глобулами, собираются по принципу самосборки (самопроизвольно, но упорядоченно). Белковые субъединицы, образующие нуклеокапсид, несут как неизменяющиеся комплементарные поверхности, так и разупорядоченные участки, которые упорядочиваются при сборке, играя роль «зажима» для РНК (РНК-связывающий центр). В случае вируса табачной мозаики (безоболочечный, палочковидный, цитоплазматический (+)РНК-содержащий вирус, входящий в блуждающий род Tobamovirus) морфогенез ВЧ проходит 4 стадии: 1. Образование структуры, состоящей из двух дисков, сформированных белковыми субъединицами. 2. Образование инициаторной петли РНК. 3. Встраивание петли РНК в отверстие диска (инициация сборки). 4. Элонгация (собственно сборка) — идет в двух направлениях вдоль цепи РНК, сопровождается закручиванием спирали рибонуклеопротеина. Такой механизм образования рибонуклеопротеида в общих чертах имеют как безоболочечные палочковидные и нитевидные вирусы, так и оболочечные вирусы со спиральным типом симметрии внутреннего компонента.
Пример 2. Сборка вирионов с икосаэдральным типом симметрии также протекает по принципу самосборки, однако, как правило, капсид собирается из преформированных структурных единиц. Капсидполиовируса состоит из 60-ти структурных единиц, каждая из которых образована четырьмя полипептидами (VP1, VP2, VP3, VP4). В процессе морфогенеза на первой стадии происходит ассоциация VP0, VP1 и VP3, в результате чего образуется протомер. Пять протомеров агрегируют с образованием пентамера, пентамеры образуют рыхлыйпровирион. Есть предположение, что на этой стадии происходит инкапсидация РНК, однако механизм ее упаковки неясен. На последней стадии происходит протеолиз VP0 с образованием VP2 и VP4, что приводит к конформационным перестройкам в капсиде и, как следствие, к уплотнению структуры капсида.
Пример 3. Сборка капсида из преформированныхсубансамблей на примере ядерного аденовируса. Вирусные белки синтезируются в цитоплазме, затем транспортируются в ядро. Для таких белков предусмотрен механизм проникновения через ядерные поры за счет специальных нуклеофильных сигналов, расположенных на N- или C-конце полипептида. Так, белки аденовируса имеют на C-конце нуклеофильный сигнал из пяти аминокислотных остатков, а белки ядерного обезьяньего вируса SV40 — из семи. Капсидаденовириона состоит из 252 структурных единиц, организованных в 12 пентонов, расположенных на вершинах икосаэдра, и 240 гексонов. Названия пентон и гексон происходят от числа структурных единиц, окружающих данное образование. Пентон — окружен 5 гексонами, гексон — 6-ю. Каждый пентон построен из 5 белков VPIII и трех белков VPIV. Группа из 9-ти гексонов (наномер) выделяется при разрушении вириона в мягких условиях и представляет собой капсомер. Морфогенез вирусной частицы протекает в 5 стадий (рис. 2). Предполагается, что при сборке икосаэдрических вирусов нуклеиновая кислота инкапсидируется после формирования незрелого вириона, проникая через отверстие в капсиде. Однако известен механизм, когда геномная нуклеиновая кислота икосаэдрического вируса не только аккумулируется в процессе сборки, но и одновременно реплицируется. Так, у реовирусов, геном которых представлен сегментированной двухнитевой РНК, морфогенез запускается в цитоплазме ассоциацией плюс-нитей РНК с белками кора и NS. В процессе созревания первого вирусного капсида происходит синтез минус-нитей РНК и их затягивание внутрь капсида. Наружныйкапсид формируется в каналах ЭПР.
Морфогенез оболочечных вирусов имеет свои особенности, так как включает стадию приобретения оболочки. У разных вирусов оболочка может приобретаться в процессе почкования через ядерную мембрану, мембрану аппарата Гольджи, мембрану ЭПР, а может формироваться непосредственно в цитоплазме зараженной клетки (поксвирусы).
Прежде чем произойдет почкование вируса через мембрану, она должна быть подготовлена (рис. 2). Это значит, в нее должны быть встроены вирусные поверхностные гликопротеины, которые синтезируются и созревают на мембранах ЭПР и Гольджи, а потом, при необходимости, перемещаются в цитоплазматическую мембрану. Затем необходимы синтез и правильная локализация матриксного белка, который располагается на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. Аутоконденсация гидрофобного матриксного белка сопровождается вытеснением белков хозяина и аккумуляцией вирусных гликопротеинов. После этого мембрана готова и вирусный внутренний компонент может быть отпочкован из клетки. Почкование идет по механизму экзоцитоза.
32. Транскрипция и трансляция у бактерий. Все молекулы РНК, образующиеся в результате транскрипции у бактерий (информационная РНК, рнбосомная РНК и транспортная РНК), синтезируются одним ферментом, РНК-полимеразой. Перед каждым геном располагается промотерная область гена, с которой начинается транскрипция. Бактериальные РНК-полимеразы состоят из пяти различных полипептидных цепей, одна из которых называется сигма-субъединицей и участвует в инициации транскрипции. Она узнает и связывается с участком однонитевой ДНК в области промотора за 10 оснований до первого копируемого основания (район называется бокс Прибнова или бокс-10) и за 35 оснований до первого копируемого основания, названного просто — 35 (первое копируемое основание называется +1, а любое основание до него получает отрицательный номер). Связывание сигмы с промотором помогает правильно связаться с ним остальным субъединицам фермента (называемым корферментом), так что транскрипция может начаться с правильной точки. Как только она начинается, сигма освобождается от корфермента и снова может участвовать в инициации транскрипции. Транскрипция останавливается, когда РНК-полимераза доходит до ДНК-последовательности, называемой терминатором. Тогда РНК-молекула отсоединяется от ДНК. Один транскрипт у бактерии может соответствовать последовательностям нескольких генов, в этом случае он называется полицистронным, или полигенным. (Это редкость дляэукариот, потому что у них в отличие от прокариот гены разделены длинными нитронами — фрагментами некодирущих последовательностей ДНК.) Получающаяся в результате молекула РНК будет иметь лидерную последовательность с 5’-конца, концевую последовательность — с 3’ -конца и пробельную последовательность (у которой нет иной функции, кроме разделения генов), разделяющую гены. Часто гены, транскрибируемые подобным образом, имеют связанные функции и транскрибируются под контролем одного промотора. В этом случае говорят, что гены составляют оперон. В отличие отэукариот у прокариот нет мембраны, отделяющей ДНК от остальной клетки. Это значит, что рибосомы могут начинать трансляцию, как только завершится транскрипция. Трансляция у бактерий имеет три основные ступени. 1. Инициация. В фазе инициации рРНК связывается со специфической последовательностью мРНК, которая запирает ее в правильном для начала трансляции положении. Как и у эукариот, кодон инициации АУГ расположен у стартового 5’-конца молекулы мРНК и кодирует метионин.Формильная группа (химическая формула СНО) присоединяется к молекуле метионина, как только аминокислота связывается с тРНК. Фермент деформилаза удаляет формильную группу с некоторых полипептидных цепей сразу после начала их синтеза. Другой фермент, аминопептидаза, может также удалять метионин с конца цепи полипептида, так что не все бактериальные белки имеют формил-метионин или метионин у стартового конца. 2. Элонгация. Рибосома начинает сборку полипептидной цепи, аминокислоту за аминокислотой, подобно тому, как делает это у эукариот. Несколько рибосом могут одновременно транскрибировать одну мРНК. Такой набор рибосом называется полирибосомой. 3. Терминация. Окончательная фаза. Ее провоцирует встреча рибосомы со стоп-кодоном в мРНК. Рибосома освобождает мРНК и движется в поисках новой матрицы мРНК для трансляции. Некоторые бактерии продуцируют белки, которые должны проходить через клеточную мембрану (например, токсины, продуцируемые многими бактериями, вызывающие пищевые отравления). Такие белки содержат дополнительно 15 — 30 аминокислот с одного конца молекулы. Они, как якорь, закрепляются в мембране, держа белок, пока он синтезируется и проходит через мембрану. Как только синтез белка завершается, фермент, называемыйсигнальной пептидазой, отрезает сигнальную последовательность от остального белка, освобождая белок, вышедший из клетки.
33.При взаимодействии вируса с клеткой могут образовываться не только зрелые инфекционные частицы, но и так называемые дефектные вирусы или ВЧ с дефектным геномом. Дефектный геном — это любой вирусный геном, в котором один или несколько генов утратили функцию, необходимую для автономной репликации вируса, в связи с чем для репликации необходима помощь другого вирусного генома или гена. Выделено 5 классов дефектных вирусных геномов, которые сохранили свою биологическую активность: 1. Дефектные геномы, зависящие от вируса-помощника. 2. Дефектные геномы, интегрированные в хромосому клетки хозяина. 3. Вирусы-сателлиты. 4. Псевдовирионы. 5. Условно-дефектные геномы. Дефектные геномы, зависящие от вируса-помошника. Сюда входят так называемые дефектные интерферирующие вирусы — ДИ-частицы. Они представляют собой субгеномныеделеционные мутанты, потерявшие существенную часть генома родительского вируса. Делеция может достигать 90%, хотя обнаруженыделеции, затрагивающие лишь 1% генома. Для восстановления утраченных функций ДИ-частицы необходимо одновременное заражение родственным вирусом-помощником. При этом, ДИ-частицы угнетают (интерферируют) репликацию вируса-помощника, используя с этой целью продукты его собственных генов. ДИ-частицы образуются при репликации любого вируса, отличаются размером от нормального вириона и имеют разную степень интерференции. Например, ДИ-частицы полиовируса интерферируют слабо, а ДИ-частицы вируса везикулярного стоматита — сильно. Дефектные геномы, интегрированные в хромосому клетки хозяина. Факт интеграции генома ряда вирусов в геном клетки хозяина в настоящее время не вызывает сомнения. Однако интегрировать могут не только полные, но и дефектные геномы, особенно в клетках бактерий. Как правило, это «молчащие» дефектные гены. В определенных условиях они могут бытьиндуцированы (активация, запуск репликации) и их экспрессия может влиять на выживаемость и эволюцию клетки хозяина. При индукции таких геномов вирусов бактерий с помощью митомицина или ультрафиолета можно наблюдать образование фрагментов вируса: пустых головок, хвостовых отростков, полных головок без отростков. Индуцированные частицы фагов могут вызывать гибель чувствительных к вирусу штаммов бактерий. Также как и нормальные интегрированные геномы, интегрированные дефектные геномы могут инактивировать гены клетки-хозяина или способствовать их экспрессии, придавать новые генетические свойства, вводить, устранять или способствовать их экспрессии, устранять или перемещать регуляторные элементы, а также способствовать рекомбинационным изменениям ДНК клетки хозяина. В последние годы установлено, что значительная часть онкогенных РНК-содержащих опухолеродных вирусов — это дефектные вирусы, несущие клеточные онкогены и зависящие от вируса-помошника. Например, LTR-последовательности дефектных ретровирусов при встраивании неподалеку от онкогенов, активируют их. Вирусы-сателлиты — крайняя форма вирусного паразитизма. Это вирусы, паразитирующие на генных продуктах, образованных другими, часто неродственными вирусами. Вирусы-сателлиты широко распространены среди вирусов растений. Вирусы-сателлиты могут так же, как ДИ-частицы, интерферировать с вирусом-помощником, однако, в отличие от ДИ-частиц, возникновение вирусов-сателлитов не связано с делецией генов вируса-помощника. Очень часто РНК- или ДНК-геном вируса-помощника не имеет гомологии с геномом вируса-паразита. Вирус-сателлит в своей репликации полностью зависит от одновременного заражения вирусом-помощником. Примеры вирусов-сателлитов: 1. STNV — сателлит вируса некроза табака, помощник — вирус некроза табака. 2. Сателлит — колифаг p4, помощник — колифаг p2. 3. AAV — аденоассоциированные вирусы, помощник — аденовирусы. 4. Дельта — вирус, помощник — вирус гепатита B. Псевдовирионы — это ВЧ, содержащие вместо геномной нуклеиновой кислоты вируса, нуклеиновую кислоту клетки хозяина. У прокариот образование такихпсевдовирусов имеет огромное генетическое значение и представляет собой механизм перемещения генетического материала клетки-хозяина из одной клетки в другую. У эукариот генетическое значение псевдовирионов не установлено, но их образование показано. Например, при инфицировании вирусом полиомы большая доля образующегося потомства представляет собой псевдовирионы. Условно-дефектные геномы — это мутантные геномы, дефектные только в определенных условиях: ts-мутанты (температурочувствительные); hr-мутанты (по спектру хозяев) и другие.