Розділ 2 Об’єкт, матеріали та методи дослідження
2.1. Виділення білків та їхня очистка. Об’єктом дослідження було обрано білок перепелиного яйця. Для проведення досліду було взято 5 яєць. Було виміряно, що загальний об’єм білку з 5 перепелиних яєць складав 20 мл. Осадження білків проводили за допомогою амоній сульфату та за допомогою дистильованої води, тому було відібрано по 10 мл білку для кожного типу висолювання.
В першому випадку, під час проведення висолювання сухий амоній сульфат попередньо розчинили, до утворення насиченого розчину. Для цього було взято 60 гр амоній сульфату та розведено у 100 мл К-фосфатного буфера. Було обрано в якості розчинника буфер, на противагу дистиляту, оскільки за рахунок буферної системи підтримується постійний рН.
В ході проведення висолювання, насичений розчин сульфату амонія додавали невеликими порціями. При постійному перемішуванні, щоб запобігти локальному підвищенню концентрації. Однак, при перемішування, білкові розчини могли змінитися, що могло призвести до втрати їхньої структури.
Оскільки, за мету було поставлено, осадити різні фракції білків, додавали різну кількість сульфату амонію, для одержання 25%, 50%, та 75% розчинів. Кожного разу, після останньої порції сульфату амонію перемішували розчин ще протягом 15 хв, для того щоб повністю осадити білки. Окрім того, було здійснено осадження білків в дистильованій воді, також з додаванням амоній сульфату, для отримання кінцевої концентрації 75%.
Наступним, після осадження білка, було необхідно відділити осад за допомогою центрифугування. Центрифугування проводили 10 хв, за швидкості в 6000 об/хв. Після центрифугування, супернатант зливали, а осад в якому знаходилися білки розчиняли за допомогою невеликої кількості К-фосфатного буфера, або дистильованої води. В результаті, було отримано 4 гомогенати. Отримані гомогенати помістили у попередньо підготовлені, та провірені на відсутність мікротріщинок, діалізні мішки. Діалізні мішки із зразками перенесли у хімічний стакан з К -фосфатним буфером. Для того щоб пришвидшити процес проходження діалізу хімічний стакан з буфером та зразками поставили на магнітну мішалку. Все це помістили у холодильник, на температуру +4°С. Окрім того, постійно міняли К-фосфатний буфер, спочатку з інтервалами у 24 години, потім кожні 2 години. Щоразу перевіряли наявність сульфату амонію за допомогою додавання насиченого розчину Ba(OH)2. Такими чином, якщо ж після його додавання у окремо відібраний невеликий об’єм буфера, в якому проводився діаліз, випадав білий осад, можна було стверджувати що діаліз ще не пройшов. О скільки повне проходження діалізу вважається лише тоді, коли не спостерігається реакції на Ba(OH)2. Однак, навіть на 6 день проведення діалізу все ще спостерігалось утворення білого осаду (BaSO4), що було дуже дивним, оскільки діаліз не може проходити на протязі такого довгого періоду часу. Однак, це також можна пояснити й тим, що за даними літератури, перепелині яйця характеризуються найвищою кількістю білків серед інших птахів. В результаті, ще через декілька днів, після того, коли не спостерігалось утворення помутніння після додавання Ba(OH)2, проведення діалізу було припинено.
2.2. Визначення концентрації білка. Для визначення концентрації білка в розчину, побудували графік залежності екстинції від кількості білка. Для цього, використовували БСА, який попередньо було розчинено водою до початкової концентрації 300мкг/мл. Далі, було здійснено його послідовне розведення до отримання концентрацій у 150 мкг/мл, , 75мкг/мл, 37,5мкг/мл та 18,75мкг/мл.
Визначення концентрації проводили за методом Лоурі. Попередньо приготовано було реактиви необхідні для проведення цього методу, а саме: Реактив А, Реактив В, та Реактив С (суміш реактиву А та В у співвідношенні 50:1). Для проведення реакції, також використовується реактив Фоліна, після додавання якого розчин набув синього забарвлення. Далі розчини спектрофотометрували на СФ-46, довжина хвилі становила 750 нм. За результатами спектрофотометра побудували калібрувальний графік. Отримані значення екстинкцій наведено нижче.
Таблиця 2.2.1. Значення екстинції розчинів БСА для методу Лоурі |
||||
Концентрації
|
Поглинання на довжині хвилі 750 нм |
|||
Е1 |
Е2 |
Е3 |
Есер. |
|
250 |
0,474 |
0,504 |
0,490 |
0,489 |
125 |
0,349 |
0,256 |
0,154 |
0,253 |
62,5 |
0,154 |
0,158 |
0,270 |
0,194 |
31,25 |
0,120 |
0,106 |
0,100 |
0,109 |
15,225 |
0,082 |
0,072 |
0,070 |
0,078 |
За результатами екстинкцій було побудовано калібрувальний графік (рис.4).
Рис. 4. Калібрувальний графік БСА за методом Лоурі.
2.3. Розділення суміші білків за допомогою гель - фільтрації. Для розділення суміші білків на окремі фракції проводили колонкову гель-фільтрацію. В якості сорбенту було взято сефадекс G-100, оскільки в нього є достатньо широкий інтервал фракціонування (4000-150000 Да).
Для того, щоб визначити яку кількість зразків білку наносити на хроматографічну колонку, визначали екстинкцію білків у досліджуваних розчинах, з різними розведеннями. Дані наведено нижче.
Таблиця 2.3.1.
|
|
Проби |
|||
|
|
дист |
25 |
50 |
75 |
Розведення |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
256 |
0,130 |
0,340 |
0,200 |
0,912 |
|
128 |
0,264 |
0,425 |
0,418 |
1,317 |
|
64 |
0,452 |
0,712 |
0,741 |
1,597 |
|
32 |
0,678 |
1,120 |
1,140 |
|
|
За цими результатами, було пораховано концентрації досліджуваних розчинів. Отримано було такі результати:
С (дист. 75%) = 14, 336 мкг/мл;
С ( 25%) = 36,608 мкг/мл;
С (50%) = 23,296 мкг/мл;
С (75%) = 99, 328 мкг/мл.
За цими даними, було вирішено взяти 1 мл зразка з конц. 75%, (дист.), 0,5 мл зразка з конц. 25%, 1 мл зразка з конц. 50%, та 0,5 мл зразка з конц. 75%. Всього, на хроматографічну колонку наносили 3 мл суміші білків та 3 мл К-фосфатного буферу. Була встановлена робоча швидкість, що становила 3 мл за 9 хв. Однак, під час проходження хроматографії, уже після 10 проби, хроматографія зупинилася. Хроматографію було проведено ще раз, однак повторилося теж саме, і уже після 10 проби колонка знову зупинилася. Причиною цього було неправильно визначена концентрація білку, та відповідно завелика кількість зразку була нанесена на колонку. Відповідно, хроматографію було проведено ще раз. Було взято меншу кількість зразку, та встановлено нову робочу швидкість - 3 мл за 5 хв. В результаті отримали 60 проб. Результати екстинкції наведені нижче.
Таблиця 2.3.2.
№ фракції |
Е280 |
№ фракції |
Е280 |
№ фракції |
Е280 |
1 |
0,063 |
21 |
0,049 |
41 |
0,063 |
2 |
0,061 |
22 |
0,049 |
42 |
0,074 |
3 |
0,071 |
23 |
0,048 |
43 |
0,072 |
4 |
0,086 |
24 |
0,066 |
44 |
0,053 |
5 |
0,068 |
25 |
0,075 |
45 |
0,047 |
6 |
0,077 |
26 |
0,073 |
46 |
0,040 |
7 |
0,071 |
27 |
0,063 |
47 |
0,049 |
8 |
0,089 |
28 |
0,056 |
48 |
0,055 |
9 |
0,270 |
29 |
0,051 |
49 |
0,091 |
10 |
0,293 |
30 |
0,042 |
50 |
0,068 |
11 |
0,344 |
31 |
0,047 |
51 |
0,058 |
12 |
0,575 |
32 |
0,061 |
52 |
0,028 |
13 |
0,745 |
33 |
0,058 |
53 |
0,086 |
14 |
0,947 |
34 |
0,056 |
54 |
0,085 |
15 |
1,009 |
35 |
0,053 |
55 |
0,075 |
16 |
0,814 |
36 |
0,053 |
56 |
0,056 |
17 |
0,445 |
37 |
0,041 |
57 |
0,052 |
18 |
0,215 |
38 |
0,058 |
58 |
0,048 |
19 |
0,099 |
39 |
0,056 |
59 |
0,047 |
20 |
0,078 |
40 |
0,072 |
60 |
0,044 |
За отриманими результатами хроматографії було побудовано калібрувальний графік (рис. 5). При довжині хвилі 750 нм, визначили екстинкції отриманих піків. Таким чином, перший пік (розведення в 4 рази) - 0, 510., Другий пік (розведення в 2 рази) - 0, 769, третій пік - 0, 014, четвертий пік - 0, 015.
Рис. 5. Калібрувальний графік досліджуваного білку, за результатами проведення хроматографії.
2.4. Електрофорез. За результатами спектрофотометрії зразків, отриманих після хроматографії, для електрофорезу було обрано ті зразки, значення екстинкції яких свідчили про наявність білка в розчині. Електрофорез робили в поліакриламідному гелі, з додаванням додецилсульфату-Na. Окрім того гель складався з розділяючого та концентруючого шарів. В якості маркера було обрано БСА. Було нанесено 9 зразків. 5 з них це зразки невдало-проведених хроматографій, останні 4 - зразки хроматографії, що пройшла нормально. Отримані результати електрофорезу наведено нижче.
Рис.6. Результати електрофорезу. (Досліджувані нами зразки з 3- по 9 проби.)