Міністерство освіти і науки України

Національний університет «Києво-Могилянська академія»

Факультет природничих наук

Кафедра біології

Звіт з проходження лабораторного практикуму з курсу

«Фізико-хімічні методи в біології»

на тему:

«Дослідження яєчного білка перепілки»

Виконала

Студентка ФПрН-3

Іванців Софія

Перевірила

Ст. викл., доцент.

Куниця Наталія Іванівна

Київ – 2012

ЗМІСТ

	Стор.
ВСТУП_____________________________________________________
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ_______________________________ Методи виділення і аналізу білків__________________________
Висолювання (осадження) білків__________________________
Діаліз__________________________________________________
Метод Лоурі___________________________________________
Метод спектрофотометрії________________________________
Гель-фільтрація_________________________________________
Електрофоретичне розділення білків_______________________ РОЗДІЛ 2. ОБЄКТ, МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ____
2.1. Виділення білків та їхня очистка____________________________
2.2. Визначення концентрації білка _________________________ ____ 2.3. Розділення суміші білків за допомогою гель-фільтрації_________ 2.4. Електрофорез____________________________________________
РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
ВИСНОВКИ_________________________________________________
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ__________________________

ВСТУП

Білки (протеїни), мабуть, один з найбільш важливих класів біохімічних молекул, які виконують різноманітні функції, та разом з нуклеїновими кислотами є найважливішими компонентами живого організму. Це високомолекулярні, нерозгалужені, азотовмісні органічні полімери, мономерними одиницями яких є   -амінокислоти, а саме - 20 стандартних, основних амінокислот, які з’єднуються між собою з утворенням пептидних зв’язків, даючи при цьому велику різноманітність молекул білків. Окрім основних амінокислот до складу білків можуть також входити мінорні амінокислоти.

На сьогоднішній день для виділення та аналізу білків використовують різні фізико-хімічні методи, а кожен етап виділення, розділення та очищення, є ступінчастим процесом та складається з багатьох послідовних етапів, необхідних для отримання індивідуального білка.

Метою даної роботи є дослідження вмісту білка перепелиного яйця, з використанням різних фізико-хімічних методів.

Завдання:

1. Здійснити аналіз даних літератури щодо методів, які будуть використовуватися для виділення та аналізу досліджуваного білка.

2. Провести виділення та очистку досліджуваного матеріалу.

3. За допомогою різних фізико-хімічних методів, встановити концентрації, та розділити суміш білків.

4. Проаналізувати результати дослідження.

Розділ 1 огляд літератури

До складу перепелиного яйця входять усі речовини, які забезпечують ріст і роз­виток зародка. Хімічний склад перепелиних яєць коливається і залежить від виду, породи, віку, годівлі та часу коли було знесене яйце. Основною складовою частиною вмісту яйця є вода. На другому місці за кількісним вмістом стоять органічні сполуки, головним чином білки та жири. У яйці також містяться вітаміни (B1, В2, В6, РР, А, D, Е, К та ін.), мінеральні речовини. Харчова цінність перепелиних яєць визначається високим вмістом у них пов­ноцінних і легкозасвоюваних білків. Перепелині яйця містять усі незамінні амінокислоти.

Близько 12,8 % загальної маси перепелиного яйця займає білок. В свою чергу білок складається з різних фракцій:

• овоальбуміни - 69,7 %;

• кональбуміни - 9,5 %;

• овомукоїд - 2,7 %;

• овоглобулин - 6,7 %;

• овомуцин - 1,9 %;

• лізоцим - 3, 0 %:

• авідин - 0,05 %.

Найціннішими є овальбумін та кональбумін, що містять усі незамінні амінокислоти у співвідношеннях, які наближаються до оптимальних, тому ці білки легко засвоюються організмом. Овоальбумін забезпечує добру розчинність яєчного білка у воді, овоглобулін здатний при збиванні утворювати піну, овомуцин стабілізує піну, лізоцим має бактерицидні властивості, які зникають при старінні яєць. Овомукоїд пригнічує дію ферменту трипсину.

Окрім того до складу яєчного білка перепелиних яєць, які інших птиць, входить невелика кількість ферментів, таких як протеази, амінопептидази, каталази, оксидази, та інші; вітаміни, такі як В1, В1, РР, а також мікроелементи, а саме - цинк, залізо, та мідь.

Для дослідження яєчного білку використовують різні методи, черед яких найбільш поширеними є

1.1. Методи виділення і аналізу білків

1. Висолювання (осадження) білків.

Випадання білків в осад, під час дії розчинів нейтральних солей амонію, лужних і лужноземельних металів називається висолюванням. Солі лужних і лужноземельних металів викликають зворотне осадження білків, тобто після їх видалення білки знову набувають здатності розчинятися, зберігаючи при цьому свої нативні властивості.

Під час висолювання відбувається дегідратація макромолекул білка, і нейтралізація заряду білкових частинок, за допомогою іонів солей, які адсорбуються на них. У зв’язку з цим, білкові розчини втрачають свою стійкість, частинки білка злипаються і випадають в осад.

На процес висолювання впливає ряд факторів:

1. Гідрофільність білка.

2. Відносна молекулярна маса білка.

3. Заряд білка.

4. Природа і концентрація солі.

5. рН середовища та температура.

Таким чином, розчинність білків сильно залежить від концентрації солей (від іонної сили). В дистильованій воді білки зазвичай розчиняються погано, однак їх розчинність зростає у міру збільшення іонної сили. Зі збільшенням іонної сили молекули білків позбавляються гідратних оболонок, що, як було вказано вище, і призводить до випадання їх в осад. У зв’язку з цим, для висолювання різних білків необхідна різна концентрація одних і тих же солей. Наприклад, різні білки висолюються з розчинів при різних концентраціях нейтральних розчинів сульфату амонія - (NH₄)₂SO₄, так - альбуміни осаджуються насиченим, 100 % розчином сульфату амонія, оскільки у них відносна маса більша ні ж у глобулінів, а глобуліни осаджуються напівнасиченим, 50 % розчином сульфату амонію. Також, чим більш розчинність білка, тим більша концентрація солі необхідна для його висолювання.

2. Діаліз.

Діалізом називається процес розділення високомолекулярних і низь молекулярних речовин за допомогою напівпроникних мембран. При цьому низькомолекулярні речовини заміщуються буфером.

Діаліз широко використовується для очищення білків від наявності низькомолекулярних сполук (солей, цукрів та ін..), які легко проходять через пори напівпроникних мембран. Білкові молекули, мають великі молекулярні маси, тому не можуть проникати через штучні, або природні мембрани (колоїд, пергамент, целофан, та ін.).

Пристрій, в якому проводиться діаліз називається діалізатором. Найпростіший діалізатор являє собою мішечок із напівпроникного матеріалу, в який заливається діалізуюча речовина(рис.1.).

Рис. 1. Схема діалізатора, та спрощена схема дифузії речовин через напівпроникну мембрану.

Мішечок опускається в стакан з буфером. Білок залишається в мішечку, а низькомолекулярні речовини шляхом дифузії проходять через мембрану і зовнішній розчин.

Традиційним є спосіб діалізу через целофановий мішечок. Для повного видалення низькомолекулярних речовин в процесі діалізу необхідна постійна зміна буферного розчину в діалізаті. Після багаторазової заміни зовнішнього буферного розчину, склад середовища в діалізному мішечку (концентрація солей, рН та ін..) буде таким же , що й у зовнішньому розчині.