2. Метод Лоурі.

Метод Лоурі - один з колориметричних методів кількісного визначення білка в розчині. Запропонований Лоурі (Lowry) в 1951 році. Принцип методу полягає в тому, що в лужному середовищі, іони Cu⁺² утворюють комплекс з пептидними зв’язками, і переходять в Cu⁺ . Одновалентні іони міді, а також радикальні групи тирозину, триптофану, та цистеїну, реагують з реактивом Фоліна (фосфомолібденова кислота з фенолом), утворюють нестабільний продукт, який переходить в молібденову синь, під дією тирозина, і триптофана, з максимумом поглинання при 750 нм. Збільшення поглинання при 750 нм пропорційно концентрації білка. Чутливість до білка становить 10 - 100 мкг/мл. Метод є дуже чутливим щодо наявності в розчині інших речовин, які в свою чергу можуть мішати при визначення білка з реактивом Фоліна. До таких речовин можна віднести гуанін, ксантин, феноли ( за виключенням нітрофенолу), амінокислоти тирозин, гліцин, гістидин, також вплив має сульфат амонія, гідразин. Визначенню білка за допомогою метода Лоурі також перешкоджають тіолові сполуки, вуглеводи, гліцерин, детергенти, інои калію, дисульфідні реагенти, антибіотики, та інші фізіологічно-активні речовини. Наявність в білкових препаратах продуктів перекисного окислення ліпідів також може призвести до незначних помилок. Також, деякі речовини, які використовуються для приготування буферних розчинів, окрім утворення неспецифічної зафарбованої сполуки, знижує взаємодію реактива Фоліна з білками. Таким чином, при використанні метода Лоурі, велика кількість різних сполук може спотворити картину справжнього вмісту білка і його фракцій. Ще одним недоліком даного методу є те, що використовуються два реактиви, які мають невеликий термін зберігання.

2. Метод спектрофотометрії.

Пристрій для визначення спектральних залежностей коефіцієнта пропускання, або оптичної густини називається спектрофотометром. Найчастіше. Спектрофотометри мають діапазон вимірів по довжинам хвиль від 180 - до 1100 нм. Цей діапазон включає в себе три області спектра: ультрафіолетову (УФ) - 180-380 нм; видиму - 380-760 нм та інфрачервону (ІЧ) - 760-1100 нм. Спектри поглинання світла речовиною, визначаються різницею енергій між енергетичними рівнями при переході електронів з нижнього рівня на вищий, та можливістю переходів між рівнями.

Визначення концентрації білка методом спектрофотометрії побудований на здатності ароматичних амінокислот, а саме - триптофана, тирозина, і меншою мірою фенілаланіна, поглинати ультрафіолетове випромінювання при довжині хвилі у 280 нм. Спектральні властивості триптофана визначаються його індольним кільцем. Триптофан має дві області поглинання - в області 218 та 280 нм. Молярний коефіцієнт поглинання цієї амінокислоти в 4 рази більший ніж тирозина, та в 30 разів більший ніж у фенілаланіна. Спектр поглинання тирозина обумовлений його фенольним кільцем. Максимум знаходиться при 222 та 275 нм. Спектральні властивості фенілаланіна визначаються його бензольним ядром. Спектр характеризується максимумом при 275 нм. Більшість білків має максимум поглинання при довжині хвилі у 280 нм. Вимірюючи величину оптичної густини за довжини хвилі 280 нм визначають кількість білка в розчині. Однак, білки відрізняються між собою за складом ароматичних амінокислот, тому їх поглинання в ультрафіолетовій області спектра може сильно відрізнятися. Окрім того, невелике помутніння розчину може призвести до помилок під час вимірювань.