Лабораторная работа №2

РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Цель работы – закрепить знания по теме «Липиды» и определить методом тонкослойной хроматографии отдельные фракции липидов сыворотки или плазмы крови, характеризующие липидный обмен организма и функцию печени.

Метод основан на различной скорости перемещения липидных фракций сыворотки крови (фосфолипиды, свободные жирные кислоты, холестерин, триацилглицериды) в тонком слое адсорбента при движении через него органического растворителя. Скорость разделения фракций зависит от их относительной полярности, и для их обнаружения полученные хроматограммы обрабатывают парами йода.

Исследуемый материал: сыворотка или плазма крови.

Реактивы:

1. Этанол – диэтиловый эфир (3:1).

2. Хлороформ.

3. Растворитель для хроматографии: н-гексан – диэтиловый эфир – уксусная кислота (73:25:2).

4. Йод металлический.

Оборудование:

1. Пластинки хроматографические Силуфол УФ₂₅₄.

2. Камера для хроматографии.

3. Водяная баня.

4. Мерная колба на 25 мл.

5. Выпарительная чашка.

6. Пипетка на 10 мкл.

7. Камера для проявления хроматограмм.

8. Хроматоскоп.

Ход работы. В мерной колбе на 25 мл смешивают 1 мл исследуемой сыворотки крови с 10 мл приготовленной спиртово-эфирной смеси. Колбу с содержимым помещают на 30 с в кипящую водяную баню, охлаждают под струей холодной воды и доводят объем спиртово-эфирной смесью до 25 мл. Полученный липидный экстракт отфильтровывают через обезжиренный бумажный фильтр в выпарительную чашку, выпаривают досуха в кипящей водяной бане, а осадок растворяют в 0,2 мл хлороформа.

В хроматографическую камеру наливают 3 мл растворителя для хроматографии. На хроматографическую пластинку, отступая 1 см от края, пипеткой наносят 10 мкл хлороформного экстракта, помещают пластинку в камеру этим концом вниз, погрузив его на 3-5 мм в растворитель. Камеру закрывают крышкой для поддержания равномерной концентрации паров. Хроматографию проводят при комнатной температуре до тех пор, пока фронт растворителя не приблизится к верхнему краю, не доходя до него 0,5 см.

Полученную хроматограмму извлекают из камеры, высушивают на воздухе и вносят для проявления в камеру, на дно которой предварительно насыпают кристаллы металлического йода. Сосуд закрывают и подогревают на водяной бане при 60^оС. Возгоняющийся йод вступает в реакцию с липидными фракциями.

Через 1 мин хроматограмму извлекают и просматривают в ультрафиолетовом свете на хроматоскопе. Фракции липидов обнаруживают в виде коричневых пятен. Ближе к линии старта расположены фосфолипиды, затем неидентифицированные соединения, холестерин, моноацилглицериды, диацилглицериды, свободные жирные кислоты, триацилглицериды и эфиры холестерина.

Указания к составлению отчета. Зарисовать полученную хроматограмму, указав в ней соответствующие липидные фракции сыворотки крови. Написать формулы представителей каждой липидной фракции в порядке убывания их относительной полярности.

Контрольные вопросы:

1. Повторите классификацию липидов.

2. Вспомните строение холестерина и его эфиров.

3. От чего зависит скорость перемещения липидов в слое сорбента при использовании органического растворителя?

4. Как возможно количественно определить липидные компоненты после разделения их методом ТСХ?