Лабораторная работа №5

РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ

Цель работы. – закрепить знания по теме «Физико-химические свойства белков» и овладеть навыками осаждения белков.

Существует большое количество разнообразных реакций осаждения белков. Как правило, реакции осаждения являются первой стадией процесса выделения, очистки, качественного и количественного определения отдельных белков. В зависимости от применяемого осадителя реакции осаждения могут быть обратимыми и необратимыми. В случае обратимых реакций белки не подвергаются глубоким изменениям и получаемые осадки могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе, обычно в воде. Белки при этом сохраняют свои свойства. При необратимых реакциях осажденные белки подвергаются глубоким изменениям (денатурации), утрачивают свои биологические и физико-химические свойства, становятся менее гидрофильными и теряют способность растворяться в воде.

Исследуемый материал: сыворотка крови или 1% раствор яичного белка.

Реактивы:

1. 10% раствор сульфата меди.

2. Концентрированная азотная кислота.

3. 10% раствор трихлоруксусной кислоты.

4. Этиловый спирт или ацетон.

5. Насыщенный раствор хлорида натрия.

Оборудование:

1. Штатив с пробирками.

2. Пипетки.

Ход работы.

1. Осаждение белков солями тяжелых металлов

Метод основан на свойстве ионов тяжелых металлов связываться с функциональными группами боковых радикалов аминокислот в молекуле белка, в результате чего разрушается ее пространственная структура и происходит осаждение денатурированного белка. При добавлении избытка солей тяжелых металлов (кроме AgNO₃ и HgCl₂) происходит растворение первоначально образующегося осадка из-за абсорбции иона металла и приобретения вследствие этого белковой молекулой положительного заряда.

К 5 каплям исследуемого раствора белка прибавляют осторожно 1 каплю 10% раствора сульфата меди. Образуется бледно-голубой осадок, нерастворимый в воде. К другой такой же порции раствора белка приливают вначале 1 каплю 10% раствора сульфата меди, а затем еще 10 капель и наблюдают растворение осадка в избытке реактива.

2. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Метод основан на способности минеральных кислот вызывать нейтрализацию зарядов и разрушение пространственной структуры белка, что приводит к его денатурации и осаждению. Ортофосфорная кислота осадка не дает. В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется.

К 5 каплям концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке наклоненной пробирки приливают 5 капель исследуемого раствора белка таким образом, чтобы жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца. Осторожно встряхивают пробирку и добавляют избыток азотной кислоты. Осадок не исчезает, так как в избытке азотной кислоты он не растворяется.

3. Осаждение белков органическими кислотами

Метод основан на способности органических кислот нейтрализовать заряд молекулы белка и разрушать ее пространственную структуру, что приводит к денатурации и осаждению белка. Органические кислоты вызывают необратимое осаждение белков.

Трихлоруксусная кислота способна осаждать только белки и не осаждает продукты распада белков. При использовании трихлоруксусной кислоты удается отдельно определить содержание азота белков и азота других азотсодержащих веществ: пептидов, мочевины, аминокислот.

К 5 каплям исследуемого раствора белка добавляют 2 капли 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.