2. Подготовка сорбента

Около 10 г волокнистой КМ-целлюлозы предварительно замачива­ют в 50-кратном объеме дистиллированной воды и оставляют набухать на сутки.

Набухшую КМ-целлюлозу отделяют от воды фильтрованием на во­ронке Бюхнера или декантацией, после чего сорбент переводят в Н - фор­му. Для этого сорбент сначала обрабатывают 10-кратным объемом 0,5 н N'aOH. тщательно перемешивая в течение 15 минут. Осадок отфильтровы­вают и промывают дистиллированной водой до pH 7.0. Затем КМ- целлюлозу в течение 15 мин перемешивают в 10-кратном объеме 0,5 н НС1. после чего ее отмывают дистиллированной водой до pH воды 5.0 5.2. Полученную КМ-целлюлозу в Н -форме уравновешивают стартовым буфером. Для этого сорбент помешают в 10-кратный объем стартового б\фера и с помощью концентрированного раствора основного компонента буфера доводят pH до значения pH буфера.

В качестве стартового буфера для разделения исследуемых белков рекомендуется использовать 0,01 М ацетатный буфер, рН= 5,0.

2. Заполнение колонки и внесение образца

Суспензию КМ-целлюлозы в Н^т- форме, находящуюся в стартовом буфере, загружают в колонку. Для этого колонку предварительно на УЗ заполняют стартовым буфером. Кран-зажим на выходе из колонки должен быть закрыт. Загрузку сорбента осуществляют с помощью скальпеля и стеклянной палочки. Сорбент аккуратно уплотняют в колонке, следя за тем, чтобы в нем не образовывались воздушные полости. Избыток буфера удаляют, приоткрывая кран-зажим. Делают это осторожно, чтобы не до­пустить "высыхания" сорбента. Для этого необходимо, чтобы над поверх­ностью сорбента всегда оставался слой буфера в 2-5 см. После внесения всего сорбента придают верхнему слою ровную поверхность (с помощью палочки). Можно на поверхность положить кружок фильтровальной бума­ги (диаметр кружка должен соответствовать диаметру колонки).

В готовую колонку вносят 3 мл смеси белков. Белки должны быть растворены в буфере, pH и ионная сила которого идентичны стартовому буферу. Внесение белков в колонку можно производить несколькими спо­собами. Самый простой из них заключается в следующем: жидкость с по­верхности наполнителя осторожно удаляют, оставляя слой в 1-2 мм; при помощи пипетки осторожно вносят образец и, открыв нижний кран, дают ему впитаться; остатки образца над сорбентом смывают небольшой пор­цией элюента; после того, как он впитается поверхностью наполнителя, добавляют новые порции элюирующего раствора, создавая слой в 5-10 см.

2. Элюция белков с колонки

Колонку соединяют с резервуаром Б. Отделение белков, не связы­вающихся с КМ-целлюлозой, проводят, пропуская через колонку исход­ный буфер. В этом случае в колонку подают элюент только из резервуара Б: резервуар А ири этом отключают. Рекомендуется пропускать через ко­лонку не менее 1,5 объема, исходного буфера (относительно объема сор­бента).

Вытекающий из колонки элюат собирают порпиями по 5 мл. В каж­дой фракции определяют концентрацию белка спектрофотометрически при 280 нм. В том случае, если из колонки будут выходить белки. элю- Цию необходимо продолжать до тех пор. пока белки полностью не выйдут.

Для отделения белков, взаимодействующих с сорбентом, проводят градиентную элюиию, увеличивая концентрацию NaCl в буфере от 0 до

0. 5 М. С этой целью доливают в резервуар Б исходный буфер до конечно­го объема 150 мл и подсоединяют резервуар А. в котором находится 150 мл оуфера. содержащего 0,5н NaCl. Включают насос и начинают собирать фракции. После окончания элюирования в режиме линейной элюции насос икот, отключают. Для отделения белков очень прочно связывающихся с иомообменником,через колонку пропускают I М раствор NaCI.