4. Обработ ка экспериментальных данных

На основании полученных результатов рассчитывают аепень очи­стки и выход цитохрома в каждой высоленной фракции.

Для этого сначала оценивают количество общего белка (А) и коли­чество цитохрома Р₄₅₀ (В) в клеточном экстракте и в каждой фракции:

А = ОДгво' V ; В = 0/WV

Затем определяют удельное (относительное) содержание иитохрома 1*450 в общем белке:

С = В / А.

Выход цитохрома Р₄₅₀ определяют по отношению количества цито­хрома в высоленной фракции к его количеству в клеточном экстракте:

Д = Вфр 100 / в^

Степень очистки рассчитывают по отношению удельного содержания ци­тохрома Р450 в выделенной фракции к удельному содержанию этого белка в клеточном экстракте:

Е = Сфр / С*/,

На основании расчетов необходимо сделать заключение о диапазоне насыщения сульфатом аммония, в котором осаждается цитохром Р_450ти выдать рекомендации по оптимизации схемы очистки искомого белка от сопутствующих белков.

Техника безопасности

При разделении суспензии на центрифуге руководствоваться инст­рукцией (документация на рабочее место № 4). Перед включением прове­рить исправность розетки, шнура, вилки, а также наличия заземления. Тщательно уравновешивать стаканы. При наличии посторонних звуков выключить центрифугу и сообщить учебному персоналу. При работе на спектрофотометре руководствоваться документацией на рабочее место № 5.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

Разделение белков методом ионообменной хроматографии

Ионообменная хроматофафия основана на притяжении, возникаю­щем между противоположно заряженными частицами. Многие биологиче­ские соединения, в первую очередь такие, как аминокислоты, пептиды, белки, содержат в своем составе функциональные группы, способные к ионизации В растворах такие группы обусловливают суммарный положи­тельный или отрицательный заряд молекулы, величина которого зависит от pH раствора и изоэлектрической точки.

Разделение веществ методом ионообменной хроматографии обычно проводят в колонках, заполненных специальной ионообменной смолой. Колонки представляют собой полые стеклянные трубки, размер которых зависит от целей работы и способа разделения. В основании колонки впаивают пористую стеклянную пластинку, перфорированный диск или поролон.

Ионообменные смолы бывают двух типов - катионообменники и анионообменники. Катионообменники содержат отрицательно заряжен­ные группы, которые притягивают к себе положительно заряженные мо­лекулы. Анионообменники, наоборот, содержат положительно заряжен­ные группы и притягивают молекулы с отрицательным суммарным заря­дом.

Большинство ионообменных смол получают путем сополимериза- ции стирола и дивинидбензола. Однако такие смолы при анализе белков имеют ограниченное применение. Это вызвано несколькими причинами. Во-первых, при взаимодействии со смолами высокомолекулярные белки подвергаются денатурации и необратимо связываются с ними. Во-вторых, емкость смол по отношению к белкам сравнительно низка, а чистота раз­деленных фракций не вполне удовлетворительна.

В последнее время для ионообменной хроматографии белков стали использовать целлюлозы и ионообменные полимеры декстрана. Преиму­щество этих ионообменников состоит в том, что их гидрофильный мат­рикс хорошо связывает воду, набухает, вследствие чего улучшается про­ницаемость для крупных белковых молекул. Кроме того, они обладают более высокой емкостью к белкам и не вызывают их денатурации.

Наиболее распространенным катионообменником для белков явля­ется КМ-целлюлоза (карбоксиметилцеллюлоза), в которой группа -CHjOH замещена на группу -СН2ОСН2СОО Среди анионообменников наиболее эффективной является ДЭАЭ-целлюлоза (диэтиламиноэтилцел- люлоза).

Процесс, происходящий в колонке с ионхбменником, можно рас­смотреть на примере. Допустим, в качестве ионообменной смолы имеем ионообменник, насыщенный катионами (А*'), что достигается пропускани­ем через колонку буферного раствора, содержащего катион А⁺. Если те­перь через колонку пропустить раствор с другими катионами (B^f), то часть катионов А* будет «мешаться катионами В‘ вплоть до достижения рав­новесия: . .

Смола-О ...А + li ^— Смола - О ... В* + А

Равновесие зависит от концентрации катионов В', концентрация комплекса Смола-O'... А⁺ от относительного сродства ионообменного ма­териала к катионам А⁺ и В . По мере продвижения через колонку раство­ра, содержащего ионы В⁺, непрерывно происходит процесс уравновеши­вания, в результате чего катионы В⁺ могут полностью связаться со смолой.

11ри соответствующих условиях (pH, ионная сила раствора, скорость про­текания буфера через колонку) можно достичь того, что катионы В* свя­жутся со смолой в определенном, небольшом участке колонки.

При катионообменной хроматографии смесь белков в исходном бу­фере пропускают через колонку с катионообменником. При этом часть белков, имеющих положительный заряд, связывается с сорбентом, а часть отрицательно заряженных белков вымывается из колонки.

Белки, взаимодействующие с катионообменником, сорбируются в верхней части колонки. Для их извлечения (элюирования) через колонку пропускают подходящий буфер (элюент). Этот буфер может иметь либо такой же pH, что и исходный буфер, но большую ионную силу, либо более низкий pH. Элюирование также можно осуществлять буферами с теми же значениями pH и ионной силы, что у исходного буфера, но содержащими катион, к которому катионообменник имеет большее сродство, чем белок (чаще всего используют ионы Na⁺).

Выделение отдельных белков из смеси, сорбированной на колонке, можно проводить путем создания ступенчатой или непрерывной градиент­ной элюции. При этом виде элюции каждый из элюирующих растворов пропускают через колонку до тех пор, пока концентрация белка в выте-; кающем из колонки элюате, пройдя через максимум, не снизится почти до исходных фоновых значений.

При непрерывном градиенте изменение ионной силы или pH элюи­рующего раствора происходит постепенно, по линейной или не по линей­ной зависимости от объема протекающей жидкости. Линейное изменение ионной силы или pH элюирующего раствора происходит тогда, когда эти параметры пропорциональны объему протекающей жидкости. Получить линейный градиент можно с помощью прибора, состоящего из двух со­единенных на одном уровне (рис.4,а). В одном сосуде (1) находится бу­ферный раствор со значением ионной силы, которое должно быть достиг­нуто к концу опыта. В другом смесителе, из которого раствор поступает непосредственно в колонку, вначале находится равный объем исходного буферного раствора. Часто применяют “выпуклый” или “вогнутый” гра­диенты, при которых ионная сила раствора увеличивается соответственно по экспонентной зависимости. Форму этих градиентов легко получить с помощью простого устройства, изображенного на рис. 4, б,в.

О

V

V

Рис.4. Приборы для создания градиента концентрации

а линейного, б - выпуклого, в - вогнутого (объяснения в тексте)

Режим элюирования для разделения конкретных белковых смесей приходится подбирать эмпирически.

Целью данной работы является разделение модельной смеси бел­ков методом ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе в режиме линейной градиентной элюиии.

ХОД РАБОТЫ 1. Сборка установки

Для проведения работы собирают хроматографическую установку, изображенную на рис. 5.

Рис.5. Схема устройства для колоночной хроматографии:

I - прибор для создания линейного градиента (а - сосуд с раствором высокой концентрации: б - сосуд-смеситель; в - магнитная мешал­ка); 2 - перистальтический насос; 3 - колонка