2. Исследование зависимости активности фермента от

концентрации субстрата

Для исследования влияния концентрации субстрата на активность протеолитического препарата готовят инкубационные смеси, как показано

в таблице:

Вариант	Раствор казеина, мл	J Фосфатный буфер, мл	Раствор фермента, мл
. 1	0,25	1,75	0,5
О	0,5	1,5	0,5
р- (Ь	1.0	1.0	0.5

4. 1.5 0.5 0.5

5. 2.0 0 0,5

/

Содержимое пробирок тщательно перемешивают, отбирают нуле­вые пробы и оставляют в термостате на 10 мин при 40 °С. По истечении

времени отбирают конечные пробы.

11осле удаления белка осаждением ТХУ определяют концентрацию тирозина в пробах. Рассчитывают удельную активность ферментов в каж­дом ия вариантов. На основании полученных результатов строят график зависимости удельной активности фермента от концентрации субстрата. Концентрацию казеина в исходном растворе определяют по методу Бред­форда, по реакции с кумасси синим G 250.

Используя линейную анаморфозу уравнения Михаэлиса-Ментен,

1 _ К__ }_₊ ±

V Ути S Утя, ’

%

предложенную Лайнуивером и Берком определяют точные шачения К_т и V_Ma, для протеолитического препарата.

3. Исследование влиянии ингибитора металлопротеииаз на активность ферментного препарата

В качестве ингибитора предлагается использовать хелатирующий агент - EDTA, специфический ингибитор металлопротеииаз.

Готовят инкубационные смеси следующего состава:

Вариант	! Раствор ! фермента, мл j	Раствор казеина, мл	Фосфатный буфер, мл .. !	Раствор ЭДТА
5	0.5	1,5	0,4	0,1
6	0,5 •	!,5	0,3	0,2
7	0,5	1.5	0,2	0 1

Проводят реакцию,как в пункте 3.

Рассчитывают удельную активность и строят график зависимости удельной активности от концентрации ингибитора. Делают вывод о типе

протеолитического фермента.

Определение концентрации тирозина. В сухие пробирки вносят по 0,5 мл полученных супернатангов, по 2,5 мл 0,5 М NaOH и по 0,5 мл реактива Фолина. Содержимое пробирок быстро перемешивают и остав­ляют на 20 мин для развития синей окраски. Окрашенные растворы коло- риметрируют при длине волны - 660 нм. В качестве кюветы сравнения ис­пользуют' кювету с дистиллированной водой.

Концентрацию тирозина в супернатантах определяют по графику, представленному на рис.!. Концентрацию тирозина в реакционной смеси рассчитывают с учетом разведения пробы в 2 раза в результате разбавле­ния ТХУ. ' •<

[тирозин], мг/л

Рис. 1. Калибровочный график зависимости оптической плотности растворов (ОДьбо) от концентрации тирозина

1,2

Определение концентрации белка по методу Брэдфорда. К рас­твору, содержащему от 10 до 100 мкг белка в 0,1 мл буферного раствора, добавляют 5 мл реактива А и тщательно перемешивают.

Состав реактива А: 10,0 мг кумасси ярко-синего G-250 или R-250 растворяют в 5 мл 95 % этанола. Добавляют 10 мл 85% (вес/объем) фос­форной кислоты. Объем доводят до 100 мл дистиллированной водой.

Измеряют оптическую плотность при 595 нм. Измерения проводят не раньше, чем через 2 мин и не позже, чем через 1 час. Для сравнения используют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл буферного раствора и 5 г реактива А.

Содержание белка в пробе определяют по калибровочному графи­ку, отражающему зависимость между оптической плотностью стандарт­ных растворов и концентрацией белка в них (рис.2).

200 400 600 800

[яичный альбумин|, иг/л

Рис. 2. Калибровочный график для определения концентрации

белка