Пріони як представники неканонічних вірусів.
Пріони- білкові інфекційні частки, що є неканонічними патогенами, які викликають трансмісивні губкоподібні енцефалопатії людини та тварин (раніше їх називали повільними вірусними інфекціями) в основі яких лежить конфірмаційні перетворення, що призводять до дизпротеїнозу . Пріонний білок PrP може бути в двух ізоформах: клітинній, нормальній - PrP(c), та зміненій, патологічній – PrP(sc).
В неінфекцйній формі ці білки входять до складу мієлінових оболонок клітин ЦНС, в їх молекулах переважають альфа-спіралі. Ця форма розчинна у воді. В інфекційній конформації основною складовою білка є бета-спіралі. Такі білки утворюють нерозчинні фібрили. Якщо такий білок потрапляє в організм він викликає зміни конформації нормального білка. Утворюються довгі фібрили, які руйнують нервові клітини і призводять до розвитку губчастих енцефалопатій. Створено кілька теорій, які б пояснювали, як патологічний білок впливає на нормальний. Згідно «гетеродимерної» моделі перетворення відбувається, коли молекула клітинного білка зв’язується з пріонним мономером майбутньої фібрили. Після того як білок набув пріонної конформації, ця пара може дисоціювати та ініціювати конформаційні перетворення інших білків. Агрегація перетворених молекулу фібрили розглядається як вторинне явище. [1,2]
БІЛЕТ 2
Методи клонування днк та експресії білків у бактеріальних клітинах.
Ефективним підходом, що дозволяє розмножити будь-який конкретний фрагмент ДНК, є техніка клонування цієї ДНК у бактеріальних клітинах: фрагмент, що цікавить, вбудовується у ДНК-вектор з утворенням рекомбінантної молекули ДНК, яка вводиться у клітину (так звана трансформація). Далі залишається зачекати зростання бактеріальної культури - бактерія використовується як своєрідний біореактор.
Як вектор часто використовують бактеріальні плазміди – порівняно невеликі циркулярні молекули ДНК, що існують у клітині незалежно від бактеріальної хромосоми. Основними вимогами до плазміди як вектора є наявність у її складі ориджина реплікації, унікального
(одного на плазміду) сайта, що впізнається певною рестриктазою, і гена стійкості до одного з антибіотиків.
Рестриктази - специфічні до невеликих елементів послідовності ендонуклеази, що здійснюють розрізання обох ланцюгів ДНК. Сайтом рестрикції, що впізнається рестриктазою, є невеликі (чотири, шість, іноді трохи більше пар основ) паліндромні послідовності. Залежно від типу рестриктази, два розрізи, які вона здійснює, можуть бути розташованими точно один напроти одного у двох ланцюгах, що приводить до утворення так званих тупих (blunt) кінців. Частіше рестриктази залишають взаємно комплементарні 5'-кінцеві (а іноді 3'-кінцеві) одноланцюгові
вирости - липкі (sticky) кінці. Із метою створення рекомбінантної ДНК очищену плазміду, яка
містить єдиний сайт певної рестриктази, обробляють цією рестриктазою і отримують лінійний вектор з липкими кінцями.
Далі додають фрагмент ДНК, який було вилучено за допомогою тієї самої рестриктази. За рахунок комплементарної взаємодії між липкими кінцями фрагмента й вектора утворюється циркулярний нековалентний комплекс двох молекул ДНК. Завдяки використанню іншого ключового ферменту рекомбінантної технології - ДНК-лігази - полінуклеотидні ланцюги зшиваються. Найзручнішими є плазмідні вектори, які містять так званий полілінкер - ділянку з певним набором унікальних рестриктних сайтів, що дозволяє підібрати одну з рестриктаз, найпридатнішу для кожного випадку. Фрагменти ДНК із тупими кінцями також можна вбудувати у вектор за допомогою лігази, хоча така реакція є на порядок менш ефективною. За допомогою термінальної нуклеотидилтрансферази (фермент, який без участі матриці приєднує нуклеотиди до 3'-кінця) до 3'-кінців фрагмента ДНК можна приєднати, наприклад, одноланцюговий poly(dA)-хвіст, а до 3'-кінців лінійного вектора - poly(dT). При змішуванні між комплементарними одноланцюговими кінцями відбудеться спарювання, остаточне зшивання завершує ДНК-лігаза. Можна також утворити тупі кінці на фрагментах із липкими кінцями.
Для цього або здійснюють видалення одноланцюгових виростів за допомогою нуклеази S1 (нуклеаза, що гідролізує тільки одно ланцюгову ДНК), або липкі кінці забудовують за допомогою фрагмента Кленова ДНК-полімерази І E. coli. Утворений фрагмент із тупими
кінцями вбудовують у вектор за щойно описаною процедурою.
Трансформація бактеріальних клітин рекомбінантною плазмі дою здійснюється зазвичай у розчині CaCl 2 або шляхом електропорації (через суспензію клітин проводиться короткий імпульс електричного струму). В обох випадках підвищується проникність клітинної стінки, і рекомбінантна плазміда потрапляє всередину. Зрозуміло, що далеко не всі бактерії отримують плазміду при трансформації. І тут стає в нагоді ген стійкості до антибіотика: достатньо обробити бактеріальну культуру цим антибіотиком, щоб залишити тільки трансформовані клітини. Далі відбувається автономна реплікація плазміди та розмноження самих клітин, що призводить до значного зростання загальної кількості плазмід. Клоновані плазміди виділяють із бактеріальної культури, а обробка їх тією самою рестриктазою, що була використана при виготовленні рекомбінантної молекули, дозволяє вирізати з вектора клонований фрагмент ДНК. Трансформація бактерій плазмідами є тим ефективнішою, чим меншою за розміром є плазміда. Відповідно, існує обмеження в розмірі фрагментів, що їх можна клонувати описаним шляхом до 10 тис. пар основ.
Альтернативною, але цілком аналогічною технікою, що дозволяє працювати з фрагментами довжиною ~20 тис. пар основ, є клонування ДНК із використання векторів на основі бактеріофага λ . За допомогою рестриктази фрагмент ДНК вбудовується у фагову ДНК, додаються порожні фагові оболонки, і здійснюється збирання фагових частинок in vitro. Рекомбінантними бактеріофагами заражають бактеріальну культуру, де відбувається їхнє розмноження.
Використовуючи вектори на основі космід, можна клонувати фрагменти ДНК до 40 тис. пар основ. Косміда є плазмідою, яка крім ориджину, сайтів рестрикції та генів стійкості до антибіотиків містить два cos-сайти: липкі кінці лінійної молекули ДНК бактеріофага λ. Саме за рахунок cos-сайтів лінійна молекула фагової ДНК циркуляризується після її проникнення в бактеріальну клітину. У лінійну косміду з такими липкими кінцями вбудовується фрагмент ДНК, який бажано клонувати. Рекомбінантна косміда упаковується in vitro у фагові частинки, якими обробляють бактеріальну культуру. У цьому випадку бактеріофаг використовується як ефективний засіб трансформації: лінійна косміда проникає у клітину, де циркуляризується за рахунок cos-сайтів і бактеріальної лігази. Далі циркулярна косміда розмножується як звичайна плазміда.
Для клонування фрагментів ДНК від 100 тис. пар основ використовують спеціально сконструйовані вектори ВАС (Bacterial Artificial Chromosome) і YAC (Yeast Artificial Chromosome). BAC-вектори створено на основі F-плазмід бактерій, YAC-вектор являє собою штучну дріжджову мініхромосому, яка містить центромеру, теломери й точку початку реплікації. У такий вектор можна ввести чужорідний фрагмент ДНК розміром понад 100 тис. пар основ. Така мініхромосома, уведена в дріжджову клітину, буде реплікуватися й поводити себе
аналогічно іншим дріжджовим хромосомам при мітотичному поділі. Більшість сучасних векторних систем є поліфункціональними - придатними не тільки для клонування ДНК, а й для експресії рекомбінантних білків, про що йтиметься нижче.