81. Ретровіруси як вектори горизонтальної передачі спадкової інформації.

Ретровірусний геном складається з двох ідентичних одноланцюгових + РНК, що мають кеп і полі-А-хвіст. Два ланцюги РНК нековалентно пов’язані однин з одним біля 5’-кінця. Довжина кожного з них від 3,5 до 9 кb, залежно від виду вірусу. Наявність двох молекул РНК вказує на те, що геном диплоїдний. Геном містить гени: gag (структурні білки нуклеокапсиду), env (поверхневі білки капсиду), pol (ревертаза). Коли вірус потрапляє в клітину, він за допомогою ревертази (РНК-залежна ДНК-полімераза) синтезує дволанцюгову ДНК, яка інтегрується в геном господаря.

Ретровіруси можна використовувати у якості векторів для переносу селективних генних маркерів. Якщо такий ген оточений регуляторними елементами, то вірус може його переносити, так само як вони переносять онкогени v-onc. Така конструкція на основі ретровірусів була отримана для гену тимідинкінази.

Трансдукція – процес захоплення і перенесення вірусом генів хазяїна. Саме таким чином деякі віруси отримали онкогени у своєму складі. Ці захоплені гени разом з вірусом можуть потрапити до наступної інфікованої клітини. Є віруси, які можуть переносити захоплені гени не тільки між різними організмами одного виду, але й різних видів.

Відповідно до здатності заражати певних хазяїв ретровіруси зазвичай ділять на 3 основні групи: екотропні – реплікуються в клітинах хазяїна і близько родинних видів, ксенотропні – розмножуються тільки в клітинах, що не належать до «батьківського» виду, амфотропні – реплікуються в клітинах і природного господаря і інших видів.

БІЛЕТ 3

82. Методи секвенування днк. Встановлення нуклеотидних послідовностей геномів.

Секвенування ДНК по Сенгеру «плюс-мінус» метод. Першим методом прямого ферментативно секвенування став метод, запропонований в 1975 р. Ф.Сенгером і Д.Коулсоном. в якості матриці в реакції полімеразного копіювання використовувався одно ланцюговий фрагмент ДНК, а в якості праймерів – синтетичні олігонуклеотиди чи природні субфрагменти, отримані при гідролізі рестриктазами, а в якості фермента – фрагмент Кленова ДНК полімерази І з E.coli. Метод включав два етапи. Спочатку в обмежених умовах проводили полімеразну реакцію в присутності всіх чотирьох типів dNTP (один з яких був мічений по альфа-положенню фосфату), отримуючи на виході набір продуктів неповного копіювання матричного фрагменту. Суміш очищали від незв’язаних дезоксинуклеозидтрифосфатів. І ділили на вісім частин. Після чого в «плюс» системі проводили чотири реакції в присутності кожного з чотирьох типів нуклеотидів, а в «мінус» системі при відсутності одного з них. В результаті цього, в «мінус»системі термі нація відбувалася перед dNTP даного типу, а в «плюс» системі – після нього. Отримані таким чином 8 зразків розділяли за допомогою електрофорезу, фіксували сигнал від мітки і визначали послідовність вихідної ДНК. Таким чином була секвенована коротка ДНК фагу фХ174, що складалась з5386 п.о.

Секвенування по Сенгеру: метод «термінаторів» В 1977р. автор «плюс-мінус» метода запропонував ще один спосіб ферментативного секвенування, який отримав назву термінуючи аналогів три фосфатів. З деякими модифікаціями цей спосіб застосовується і досі. В основі метода також ферментативне копіювання матриці за допомогою фрагмента Кленова. В якості праймерів використовували синтетичні олігонуклеотиди. Специфічну термі націю синтезу забезпечували додаванням в реакційну суміш крім чотирьох типів звичайних dNTP ще й одного 2’-3’-дидезоксинуклеозидтрифосфата (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), який здатен включатися в синтезований ланцюг, але не дозволяє продовжувати синтез ланцюга через відсутність 3’-ОН групи. ddNTP несли мітку. Відношення концентрацій dNTP/ddNTP автори підбирали експериментально, та щоб в результаті отримати набір копій ДНК різної довжини. Для встановлення послідовності нуклеотидів в матричному ланцюзі проводили чотири реакції з кожним ddNTP. Отримані продукти розділяли в поліакріламідному гелі і по розташуванню смужок визначали вихідну послідовність.

Секвенування ДНК по Максаму і Гілберту. В 1976р. Максамом і Гілбертом був розроблений метод секвенування, оснований на специфічній хімічній деградації фрагмента ДНК, радіоактивно міченого з одного кінця. Препарат міченої ДНК розділяли на 4 аліквоти і кожну обробляли реагентом, що модифікує одну або дві основи. Вони запропонували обробляти пуринові основи диметилсульфатом. При цьому відбувається метилування аденінових залишків по азоту в положенні 3, а гуанінових по азоту в положенні 7. обробка зразка соляною кислотою при 0°С призводить до вищеплювання метил аденіну. Подальша інкубація при температурі 90°С в лужному середовищі викликає розрив цукро-фосфатного остову в місцях вищеплювання основ. Обробка піперидином призводить до гідролізу зразка по залишкам метилгуаніну. Піримідинові основи модифікуються гідразином. Якщо реакцію провести в безсольовому середовищі, то модифікуються і цитозин і тимін, якщо обробку вести в присутності 2М NaCl, то модифікується лише цитозин. Розщеплення ланцюга на фрагменти і в цьому випадку здійснюється піперидином. Умови реакції автори підбирали таким чином, щоб отримати повний набір субфрагментів різної довжини. Подальший електрофорез в поліакріламідному гелі дозволяє встановити повну структуру досліджуваного фрагменту.

Автоматичне секвенування ДНК

В соснові автоматичного секвенування метод термінуючи ddNTP. Воно, як і укласичний метод Сенгера включає в себе дві стадії: проведення термінуючих реакцій і розділення продуктів за допомогою електрофорезу. В цьому випадку кожен ddNTP несе різну флуоресцентну мітку. Тому можна проводити не 4 окремі реакції, а одну і фіксувати флуоресценцію від чотирьох міток.

В роботі Сенгера було використано фрагмент Кленова ДНК-полімерази І з E.сolі. Зараз використовують рекомбінантні полімерази, які не мають 3’- і 5’ екзонуклеазної активності, і для яких відсутня дискримінація по включенню в ланцюг dNTP i ddNTP. Всього існує 2 різні підходи до вибору полімерази. В першому випадку копіювання здійснюється при 37°С високопроцесивними термолабільними полімеразами (T7 DNA polymerase - Sequenase v1.0 и v2.0, Amersham Pharmacia Biotech). В другому – реалізується циклічний процес, який включає денатурацію, отжиг, елонгацію, тому використовують термостабільні полімерази (Thermo Sequenase™, Amersham Pharmacia Biotech и AmpliTaq FS™, PE Biosystems).

Отримані в результаті реакції фрагменти розділяють за допомогою електрофорезу в поліакріламідному гелі. Цей гель повинен розділять фрагменти, що розрізняються на 1 нуклеотид. Розділення повинно відбуватися в денатуруючи умовах, які запобігають ренатурації і утворенню вторинних структур. В загальному випадку ці вимоги задовольняє 5-8 % поліакріламідний гель, що містить 7 М сечовину.

Секвенування 454 Life Sciences (піросіквенс). Технологія, розроблена компанією 454 Life Sciences, називається піросеквенуванням. Сама ідею піросеквенування виникла ще на початку 90-х років, але тоді не зміг витіснити традиційний метод з використанням термінуючи нуклеотидів. Згодом розробники з 454 Life Sciences доповнили його можливостями сучасних нанотехнологій.

Весь геном випадково фрагментують на шматочки по 300-500 п.о. потім комплементарні ланцюги розділяють. До кожного ланцюга пришивають однаковий олігонуклеотид-«адаптер», який дозволяє окремим ланцюгам налипати на пластикові бусинки. Послідовність цього олігонуклеотида дозволяє потім в процесі секвенування розпізнати ДНК-матрицю. Всі операції проводять так, щоб в результаті одна бусинка була з’єднана з одним одно ланцюговим фрагментом. Кожна бусинка виявляється поміщеною в крапельку з ПЛР-сумішшю, яка оточена олією. В кожній крапельці проходить окрема реакція ПЛР. В результаті на поверхні бусинки виявляється вже багато копій фрагмента (до 10 млн.). далі емульсія руйнується, новоутворені дволанцюгові фрагменти розділяють і бусинки поміщають в лунки слайду особливої конструкції. Кожна його лунка утворює окремий піко літровий реактор, в якому і буде проходити секвенування. Кожен слайд несе близько 1,6 млн. лунок. Слайд поміщають в проточну камеру таким чином, що над отворами лунок створюється канал висотою 300 мкм, по якому в лунки потрапляють необхідна реактиви. Реактиви, які доставляються в проточну камеру, течуть перпендикулярно осі лунок. Така конфігурація дозволяє одночасно здійснювати реакції на бусинка, що несуть матрицю, в окремих лунках. Додавання і видалення реактивів здійснюється за допомогою конвекційного і дифузного переносу. Час рамки дифузії між потоком і лунками складає близько 10 секунд і залежать від висоти камери і глибини лунок. Глибина лунок вираховується, виходячи з наступних міркувань:

• лунки повинні бути досить глибокими, щоб бусинки з матрицею не вискакували з них під впливом конвекції

• вони повинні бути досить глибокими, щоб виключити дифузію продуктів з лунки в лунку

• лунки повинні бути досить дрібними для того, щоб швидко здійснювалась дифузія нуклеотидів в лунку і для швидкого вимивання нуклеотидів з лунки.

Крім бусинок з матрицею в кожну лунку додають дрібніші бусинки – кожна і іммобілізованим ферментом на ній, які здійснюють реакцію піосеквенування. Нуклеотиди (одного виду за раз) і інші необхідні реактиви подають послідовно в проточну камеру, куди поміщають слайд. Кожного разу коли відповідний нуклеотид вбудовується в ростучий ланцюг ДНК в будь-якій з лунок, в ній вивільнюється молекула пірофосфату, яка в свою чергу є необхідним попередником наступної ферментативної реакції. Її каталізує особливий фермент – люцифераза світлячка Photinus pyralis. Але для її проходження необхідно АТФ. Новоутворений пірофосфат перетворюється на АТФ під дією ще одного фермента – АТФ-сульфорилази. І тоді люцифераза окислює люциферин до оксилюциферину, а це реакція супроводжується хемілюмінісценцією. Дно слайда знаходиться в оптичному контакті з опто-волоконним світло відводом. Це дозволяє реєструвати випромінювання з кожної лунки, в якій відбулося вбудовування нуклеотиду. Відповідно зафіксованим спалахам комп’ютер послідовно відслідковує ріст ланцюжків сотнях тисяч лунок одночасно. Час необхідний для протікання ферментативної реакції, що продукує детектований спалах, складає близько 0,02-1,5 с. Після надходження в проточну камеру кожного нуклеотида вона промивається розчином, що містить апіразу. Таким чином перед тим, як в камеру потрапить наступний нуклеотид, з усіх лунок видаляються усі попередні неприєднані нуклеотиди. Визначити лунки, що містять ДНК-матрицю можна, прочитавши послідовність «адапторного2 олігонуклеотида.

В 2005 р. вчені з 454 Life Sciences, використовуючи свою технологію, зуміли розшифрувати 600000-нуклеотидний геном бактерії Mycoplasma genitalium з точністю 99,4%, а також 2100000-нуклеотидний геном Streptococcus pneumoniae.