42. Поняття про цитоскелет та його структурні елементи

Цитоскелет – це опорно-рухова система клітини. Основними функціями цитоскелету є підтримка форми клітини та забезпечення переміщення як клітини в цілому, так і внутрішньоклітинних компонентів всередині клітини. Цитоскелет складається з трьох основних компонентів: мікрофіламентів, мікротрубочок та проміжних філаментів.

Мікрофіламенти

Мікрофіламенти – це довгі нитчасті утворення діаметром приблизно 7 нм. В клітині мікрофіламенти є скрізь у цитоплазмі, але особливо багатим на мікрофіламенти є кортикальний (периферійний, поверхневий) шар цитоплазми.

Мікрофіламенти побудовані з білка актину. Молекула актину являє собою глобулярний поліпептид, який складається з 375 амінокислот. Коли молекули актину формують мікрофіламент, то вони об’єднуються одна з одною “голова в хвіст” у волокнисту структуру. Молекули актину упаковані в ній у щільну спіраль, на один виток якої приходиться приблизно два мономери актину. Така будова мікрофіламенту нагадує два взаємно скручених ланцюжки з кроком 37 нм, але ця подібність помилкова. Процес об’єднання мономерів актину в мікрофіламент називається полімеризацією актину. Але полімеризується не весь актин, який є у клітині. Певна частина молекул актину завжди перебуває у вільному деполімеризованому стані. Полімеризовану частину актину інколи називають F-актином або фібрилярним актином, а деполімеризовану (вільну) частину - G-актином або глобулярним актином.

Два кінці мікрофіламенту неоднакові; розрізняють плюс(“+”)-кінець, до якого молекули актину, здебільшого, приєднуються, та мінус(“-“)-кінець, від якого, здебільшого, від’єднуються. Тому на “+”-кінці йде зборка мікрофіламенту, а на “–“-кінці - його разборка. Завдяки зборці на одному кінці і розборці на протилежному кінці мікрофіламенти можуть переміщуватись. Це явище носить назву тредмілінг.

Процес зборки і розборки мікрофіламентів відбувається постійно. Це необхідно для постійної перебудови цитоскелету по мірі потреб клітини. Ряд речовин можуть заблокувати процес зборки або розборки мікрофіламентів. Цитохалазини, наприклад, зв’язуються з “+”-кінцем мікрофіламенту і не дають новим молекулам актину приєднуватись сюди. А оскільки молекули актину від’єднуватись від “-“-кінця продовжують, то це веде до розборки мікрофіламентів. Фалоїдини, навпаки, приєднуючись до “-“-кінців мікрофіламентів, не дають їм розбиратись.

З мікрофіламентами асоційовано ряд інших білків, які допомагають мікрофіламентам виконувати їхні функції..

Основними функціями мікрофіламентів є:

1) участь в гель-золь-переходах цитозолю;

2) участь в підтриманні форми клітини;

3) утворення мікроворсинок;

4) входять до складу проміжного міжклітинного контакту;

5) участь в переміщенні внутрішньоклітинних компонентів:

а) за рахунок зборки-розборки (тредмілінгу);

б) за рахунок транспорту по них, як по рейках;

6) утворення псевдоподій;

7) формування скоротливого кільця при цитотомії (поділі цитоплазми) в ході мітозу тваринної клітини;

8) забезпечення скорочення м’язових клітин (разом з міозином).

Велика кількість мікрофіламентів розташована в кортикальному шарі цитоплазми. Тут мікрофіламенти формують трьохмірну сітку одразу під плазмолемою клітини. Ця актинова сітка бере участь в стабілізації форми клітини. Наприклад, в еритроцитах форма двояковігнутого диска повністю забезпечується таким поверхневим цитоскелетом. Якщо цей поверхневий цитоскелет зруйнувати, то еритроцит набуває сферичної форми.

Актинові мікрофіламенти в кортикальному шарі цитоплазми зв’язані з білком спектрином . Спектрин, в свою чергу, за допомогою анкірину пов’язаний з білком смуги 3 (інтегральним білком плазмолеми) та за допомогою білка смуги 4.1 – з глікофорином (ще одним інтегральним білком плазмолеми).

За допомогою мікрофіламентів формуються мікроворсинки – тонкі пальцеподібні вирости плазмолеми, які збільшують площу контакту плазмолеми з міжклітинним простором, що збільшує площу всисної поверхні, наприклад, в епітелії кишечнику. Всередині кожної мікроворсинки знаходиться пучок з 20-30 паралельних мікрофіламентів, які йдуть від основи мікроворсинки до її верхівки . “+”-кінці всіх мікрофіламентів спрямовані до верхівки мікроворсинки.

У такий спосіб сітка мікрофіламентів кріпиться до плазмолеми і підтримує її форму. Тут до них приєднуються інші білки, які формують аморфну шапочку. Природа цих білків ще не з’ясована. Між собою мікрофіламенти скріплені за допомогою актин-зв’язувальних білків: фімбрину, фасцину і віліну. До плазмолеми мікрофіламенти кріпляться за допомогою міні-міозину та кальмодуліну. В основі кожної мікроворсинки мікрофіламенти за допомогою спектрину прикріплені до так званої термінальної сітки, яка побудована з проміжних філаментів.

Мікрофіламенти виявлені в проміжному контакті, який відносять до групи механічних міжклітинних контактів.

Мікрофіламенти також приймають участь у внутрішньоклітинному транспорті. Вони можуть переміщувати внутрішньоклітинні структури двома способами. Вище було зазначено, що за рахунок зборки на “+”-кінці і розборки на “-“-кінці мікрофіламенти можуть переміщуватись по клітині (тредмілінг). Якщо ж до такого мікрофіламенту буде прикріплено якусь внутрішньоклітинну структуру (наприклад, певну органелу), то вона теж переміститься разом з цим мікрофіламентом. Але значно більш поширеним є інший вид транспорту за участю мікрофіламентів. Мікрофіламенти можуть слугувати “рейками”, по яких переміщуються внутрішньоклітинні компоненти. “Локомотивами” тут є так звані білки-мотори. Вони одним кінцем прикріплюються до внутрішньоклітинної структури, яку слід перемістити, а другим кінцем – до мікрофіламенту. Використовуючи енергію гідролізу АТФ, білки-мотори рухаються по мікрофіламенту, і тягнуть за собою внутрішньоклітинну структуру, яку слід перемістити (рис.5.6).

Найбільш поширеними білками-моторами є міозини. В м’язових клітинах знаходиться більш важка форма міозину, а у нем’язових клітинах знаходиться більш легка форма міозину - міні-міозин. Молекула міні-міозину складається з глобулярного головного домену і короткого фібрилярного хвостового домену. Головний домен може розщеплювати АТФ (тобто, має АТФазну активність) і за рахунок цієї енергії переміщуватись по мікрофіламенту від “-“-кінця до “+”-кінця. Хвостовим доменом міозин зв’язується з органелою чи з іншою внутрішньоклітинною структурою, яку слід перемістити . Рухаючись по мікрофіламенту, міні-міозин переміщує за собою цю органелу.

Дві молекули міні-міозину можуть зв’язатись між собою своїми хвостовими доменами, а своїми головними доменами прикріпитись до двох сусідніх мікрофіламентів, розміщених антипаралельно. В цьому випадку рух головок міні-міозину по мікрофіламентах у протилежних напрямках призведе до ковзання цих двох мікрофіламентів один відносно одного. Подібний механізм лежить в основі скорочення у м’язових та у роботі актино-міозинового скоротливого кільця, яке формується при поділі цитоплазми під час мітозу тваринної. Завдяки ковзанню мікрофіламентів один відносно одного це скоротливе кільце стягується, тягнучи за собою плазмолему, і в такий спосіб розділяє клітину на дві дочірні клітини.

Актинові мікрофіламенти беруть участь в утворенні псевдоподій , за допомогою яких відбувається переміщення ряду клітин. Наприклад, так переміщуються амеби (одноклітинні організми) (тому цей спосіб переміщення клітин ще називають амебоїдним рухом), макрофаги й нейтрофіли (клітини, які виконують функцію поглинання (фагоцитозу) мікроорганізмів та сторонніх часток, що потрапили в організм).

В загальних рисах механізм амебоїдного руху виглядає наступним чином. Клітина викидає в різні боки одразу декілька псевдоподій. Деякі з цих псевдоподій прикріплюються до поверхні, по якій переміщується клітина, а деякі не можуть прикріпитись і втягуються назад.

Після прикріплення однієї якоїсь псевдоподії до поверхні, всі інші псевдоподії втягуються, а клітина немов би „підтягується” за допомогою прикріпленої псевдоподії. Таким чином, клітина переміщується на певну відстань у напрямку, де відбулося прикріплення псевдоподії. На сьогодні ще не з’ясовані всі деталі руху клітин за допомогою псевдоподій. Найкраще механізм такого руху вивчений у фібробластів. Фібробласти - це клітини сполучної тканини, які синтезують міжклітинну речовину цієї тканини. Фібробласти можуть переміщуватись по волокнах міжклітинної речовини. Виявлено, що у фібробластів до цитоплазматичного боку плазмолеми в місці, де викидається псевдоподія, підходять мікрофіламенти. Мікрофіламенти розміщуються тут або паралельним пучком, або формують розгалужені „гіллясті” структури .

Своїми “+”-кінцями мікрофіламенти повернуті до плазмолеми. По мірі росту мікрофіламентів вони стають довшими, формуються нові відгалуження, і це веде до вип’ячування плазмолеми в цьому місці. До плазмолеми мікрофіламенти кріпляться за допомогою декількох додаткових білків . Безпосередньо до актинового філаменту приєднується α-актинін та кепіруючий білок, який закриває “+”-кінець мікрофіламенту. З цими білками зв’язаний вінкулін, який своїм іншим кінцем приєднується до білку таліну. Талін може взаємодіяти з рецептором фібронектину. Цей рецептор повністю пронизує плазмолему, і з протилежного боку взаємодіє з фібронектиновим пучком. В такий спосіб формується так званий фокальний контакт. За його допомогою фібробласт прикріплюється до волокон позаклітинного матриксу і може по них переміститись. Подібний механізм, очевидно, лежить і в основі амебоїдного руху, властивого іншим клітинам.

Мікротрубочки

Мікротрубочки є ще одним компонентом цитоскелету. Це довгі трубчасті утворення діаметром приблизно 25 нм. В цитоплазмі інтерфазної клітини мікротрубочки, як правило, радіально розходяться від клітинного центра, розміщеного поблизу ядра. Деяка кількість мікротрубочок не зв’язана з клітинним центром і лежить вільно в цитоплазмі.

Мікротрубочки складаються з білка тубуліну. Існують α- і β-тубуліни. Це глобулярні поліпептиди з молекулярною масою приблизно 54 кДа.

Одна молекула α-тубуліну і одна молекула β-тубуліну об’єднуються в димер. Тубулінові димери об’єднуються один з одним “голова в хвіст” і формують протофібрилу. 13 таких протофібрил вишиковуються по колу і формують стінку мікротрубочки . Всередині мікротрубочки знаходиться порожнина. Зовнішній діаметр мікротрубочки становить приблизно 25 нм, внутрішній діаметр - приблизно 15 нм, а товщина стінки - близько 5 нм. Зборка мікротрубочок відбувається в так званих центрах організації мікротрубочок (ЦОМТ). Такими ЦОМТ в тваринних клітинах виступають головки сателітів центріолей та фібрилярне гало центріолей.

Подібно до мікрофіламентів, в мікротрубочки також розрізняють плюс (“+”)-кінець та мінус(“-“)-кінець. До “+”-кінця молекули тубуліну, в основному, приєднуються; а від “-“-кінця, в основному, від’єднуються. Тому на “+”-кінці йде зборка мікротрубочки, а на “-“-кінці - її розборка. Завдяки зборці на одному кінці і розборці на протилежному кінці мікротрубочки, як і мікрофіламенти можуть переміщуватись, тобто, також здатні до тредмілінгу.

Процес зборки і розбирання мікротрубочок відбувається постійно. Це необхідно для постійної перебудови цитоскелету по мірі потреб клітини. Є речовини, які можуть заблокувати або процес зборки мікротрубочок (наприклад, колхіцин, вінбластин), або процес розборки мікротрубочок (наприклад, таксол).

У процесі виконання своїх функцій тубулінові мікротрубочки взаємодіють з так званими БАМ- або MAP-білками (білки, асоційовані з мікротрубочками; microtubule-associated proteins). Ці білки регулюють процес зборки-розборки мікротрубочок, а також,- взаємодію мікротрубочок з іншими компонентами клітини.

Основними функціями мікротрубочок є:

1) участь в гель-золь-переходах цитозолю;

2) участь в підтриманні форми клітини;

3) участь в переміщенні внутрішньоклітинних компонентів:

а) за рахунок зборки-розборки (тредмілінгу);

б) за рахунок транспорту по них, як по рейках;

4) закріплення органел та інших внутрішньоклітинних структур в певних місцях клітини;

5) входять до складу центріолей;

6) утворення війок та джгутиків;

7) утворення веретена поділу в ході мітозу.

Участь мікротрубочок гель-золь-переходах цитозолю, так само, як і мікрофіламентів, обумовлена їх здатність до зворотної зборки та розборки. Коли більшість молекул тубуліну зібрані в мікротрубочки (полімеризовані), то цитозоль перебуває в стані гелю. Коли ж більшість молекул тубуліну перебуває у вільному (деполімеризованому) стані, то цитозоль перебуває в стані золю.

Роль мікротрубочок у процесах внутрішньоклітинного транспорту є, де в чому, подібною до ролі мікрофіламентів. Мікротрубочки можуть переміщувати внутрішньоклітинні компоненти або за рахунок зборки-розборки, або за рахунок білків-моторів, що рухаються по мікротрубочках, як по рейках. До таких білків-моторів належать динеїн і кінезин. Вони подібно до міні-міозину одним своїм кінцем прикріплюються до мікротрубочки, а іншим - до внутрішньоклітинної структури, яку слід перемістити (наприклад, до органели чи до секреторного пухирця). Використовуючи енергію гідролізу АТФ, білки-мотори рухаються по мікротрубочці і, будучи зв’язаними іншим кінцем з органелою, тягнуть її за собою. Динеїн рухається по мікротрубочці від “+”-кінця до “-“-кінця, а кінезин - від “-“-кінця до “+”-кінця мікротрубочки.

Є БАМ-білки, які одним своїм кінцем прикріплюються до мікротрубочки (але не переміщуються по ній), а іншим - до тієї чи іншої органели. В результаті органела закріплюється в певному місці клітини. Можливо, що саме таким способом закріплений у клітині апарат Гольджі, цистерни ендоплазматичної сітки та мітохондрії.

Мікротрубочки також входять до складу центріолей. Центріоля має циліндричну форму. Діаметр центріолі становить приблизно 0,15 мкм, а висота 0,3-0,5 мкм. Стінка центріолярного циліндра побудована з дев’яти триплетів мікротрубочок.

Кожен триплет розміщений під кутом 40° по відношенню до радіуса центріолі й складається з трьох мікротрубочок, які позначаються літерами A, B і C. А-мікротрубочка кожного триплета має типову будову; вона складається з 13 протофібрил. В-мікротрубочка прилягає до А-мікротрубочки, а С-мікротрубочка прилягає до В-мікротрубочки. В-мікротрубочка складається з 11 власних протофібрил, ще 2 протофібрили в неї є спільними з А-мікротрубочкою. С-мікротрубочка також складається з 11 протофібрил і має ще 2 протофібрили, спільні з В-мікротрубочкою. Від А-мікротрубочки кожного триплету відходить по два вирости (зовнішній і внутрішній), які називаються ручками. Зовнішній виріст направлений до С-мікротрубочки сусіднього триплету.

Внутрішній виріст направлений до центра центріолярного циліндра. Обидва вирости складаються з білка динеїну. Всі триплети занурені в електроннощільний дрібнозернистий матрикс. В центрі центріолі мікротрубочок немає. Тому систему мікротрубочок центріолі описують формулою 9×3+0. Центральна частина центріолі на одному з кінців (дистальному) не містить ніяких структур, а на іншому кінці (проксимальному) містить центральну втулку зішпицями. Шпиць дев’ять, вони йдуть по одній від центральної втулки до кожного триплету. Центральна втулка зі шпицями займає приблизно від 3/4 до 1/5 висоти центріолярного циліндра. На центріолі може не бути більше ніяких додаткових структур, але може бути фібрилярне гало або сателіти. Сателіти складаються з конусоподібної ніжки та округлої головки. Головки сателітів є центрами організації мікротрубочок (ЦОМТ) під час інтерфази, саме від них починається формування нових мікротрубочок цитоплазми.

Мікротрубочки при цьому є закріпленими своїм “-“-кінцем на голівці сателіта. Через деякий час мікротрубочки можуть відриватись від голівок сателітів і перебувати самостійно у цитоплазмі. Фібрилярне гало є ЦОМТ під час мітозу, від нього відходять мікротрубочки веретена поділу.

Кількість центріолей та наявність або відсутність сателітів чи фібрилярного гало закономірно змінюються протягом клітинного циклу.

На G0- та G1-стадіях інтерфази в клітині знаходиться дві центріолі: материнська та дочірня. Таку пару центріолей називають диплосомою або клітинним центром. Ці дві центріолі розміщені під прямим кутом одна до одної. При цьому дочірня центріоля повернута до материнської центріолі своїм проксимальним кінцем. На материнській центріолі знаходяться сателіти, від яких відходять мікротрубочки. На дочірній центріолі сателітів та інших додаткових структур немає, вона є “голою”.

На S-стадії інтерфази центріолі подвоюються. Для цього материнська й дочірня центріолі розходяться. Перпендикулярно до кожної з них закладаються нові центріолі. По закінченню S-фази і протягом всієї G2-фази в клітині присутні 4 центріолі, при цьому лише на одній з них (найстаршій) розміщені сателіти, інші три центріолі – “голі”.

На початку мітозу сателіти з найстаршої центріолі зникають, мікротрубочки в цитоплазмі розбираються. Одна пара центріолей (диплосома) відходить до одного полюса клітини, а інша – до протилежного. Навколо материнської центріолі в кожній диплосомі утворюється фібрилярне гало, від якого формуються мікротрубочки веретена поділу. Дочірні центріолі в складі кожної диплосоми залишаються “голими”. Після цитотомії (поділу цитоплазми) в складі кожної з двох новоутворених клітин залишається по диплосомі.

По закінченні мітозу мікротрубочки веретена поділу розбираються, на материнській центріолі зникає фібрилярне гало і формуються сателіти. Від сателітів починається утворення мікротрубочок, що функціонуватимуть в інтерфазі. Настає новий G1-період.

Мікротрубочки є також основними компонентами війок та джгутиків. Війки та джгутики є органами руху у частини найпростіших, у сперматозоїдів, за їх допомогою клітини слизової оболонки носа переміщують слиз разом з частинками пилу, тощо. В основі кожного джгутика та кожної війки знаходиться структура, що носить назву базальне тільце (рис.5.14,Б). Базальне тільце дуже подібне за будовою до центріолі і, мабуть, з неї утворюється. Стінка базального тільця побудована з дев’яти триплетів мікротрубочок, в центральній частині базального тільця мікротрубочок немає. Через це систему мікротрубочок базального тільця описують формулою: 9×3+0.

Кожен джгутик чи війка ззовні вкриті плазмолемою. Під плазмолемою знаходиться структура, побудована з мікротрубочок. Вона носить назву аксонема. Аксонема у війки та джгутика побудована з дев’яти пар мікротрубочок, які називаються дуплетами. Кожен дуплет складається з А-мікротрубочки і В-мікротрубочки. Так само, як і в центріолі та базального тільця, А-мікротрубочка побудована з 13 протофібрил, а В-мікротрубочка прилягає до А-мікротрубочки та має 11 власних протофібрил і 2 протофібрили у неї спільні з А-мікротрубочкою. А- і В-мікротрубочки аксонеми продовжуються від А- і В-мікротрубочок базального тільця. В центрі аксонеми знаходиться ще одна пара мікротрубочок. Кожна з мікротрубочок побудована з 13 протофібрил. Таким чином, систему мікротрубочок аксонеми війок і джгутиків зображують у вигляді формули: 9×2+2 (рис.5.14,А).

Крім того, мікротрубочки під час мітозу або мейозу утворюють веретено поділу - структуру, яка забезпечує розходження хромосом до дочірніх клітин.

Проміжні філаменти

Проміжні філаменти є третім компонентом цитоскелету. Це довгі нитчасті утворення діаметром близько 10 нм. Вони в різних напрямках пронизують цитоплазму. Можуть формувати так звану термінальну сітку по периферії клітини і “корзинку” навколо ядра. Крім того, проміжні філаменти формують ядерну ламіну.

Проміжні філаменти в клітинах різних тканин тваринного організму складаються з різних білків (табл.5.2). Всі ці білки на відміну від актину і тубуліну мають не глобулярну, а фібрилярну будову. В клітинах рослин проміжні філаменти не виявлені.

Всі проміжні філаменти, окрім ядерної ламіни, побудовані за єдиним планом. Спочатку дві молекули відповідного білка (кератину, якщо проміжний філамент знаходиться в епітеліальній клітині; віментину - якщо в сполучній; десміну - якщо в м’язовій; і т.д.) об’єднуються в димер (рис.5.15). C-кінці обох білкових молекул розташовуються на одному кінці димеру, а N-кінці - на іншому. Потім два димери об’єднуються в тетрамер. Але в тетрамері на кожному його кінці знаходяться C-кінці молекул одного димера і N-кінці молекул іншого димера. Саме через те, що на обох кінцях проміжного волокна частина молекул розташована C-кінцем, а частина – N-кінцем.

Проміжні філаменти на відміну від мікрофіламентів та мікротрубочок не мають “+”- та “-“-кінців, а обидва їх кінці рівнозначні. Тетрамери далі складаються “голова в хвіст” і формують протофіламент, а 8 таких протофіламентів, розміщуючись паралельним пучком, утворюють проміжне волокно (див.рис.5.15). Оскільки, як зазначено вище, проміжні філаменти не мають “+”- та “-“-кінців, то вони не здатні до тредмілінгу.

На відміну від мікрофіламентів та мікротрубочок проміжні філаменти не зазнають постійної зборки-розборки. Проміжні філаменти є найбільш стабільними компонентами цитоскелету. Саме тому основною функцією проміжних філаментів є механічна, каркасна функція. Наприклад, проміжні філаменти добре розвинені в нейронах і підтримують аксони та дендрити цих клітин.

Проміжні філаменти входять до складу десмосом та напівдесмосом - механічних міжклітинних контакті.

Крім того, проміжні філаменти є в ядрі, де вони формують ядерну ламіну. Ядерна ламіна підтримує цілісність та форму ядра, служить для прикріплення хромосом до поверхневого апарату ядра.

Взаємодії елементів цитоскелету

Мікрофіламенти, мікротрубочки та проміжні філаменти функціонують не ізольовано один від одного, а взаємодіють між собою. Так, в підтриманні форми клітини приймають участь і мікротрубочки, і мікрофіламенти, і проміжні філаменти.

Мікротрубочки радіально розходяться від клітинного центра до периферії клітини. Додатково форма клітини стабілізується завдяки кортикальному шарові цитоплазми, збагаченому мікрофіламентами. Проміжні філаменти створюють механічний каркас у цитоплазмі та у ядрі клітини. Особливо велика роль проміжних філаментів у підтриманні структури клітинних відростків, наприклад, аксонів і дендритів у нервових клітинах. Структура мікроворсинок підтримується завдяки актиновим мікрофіламентам, які йдуть паралельним пучком вздовж мікроворсинки. Своїми кінцями біля основи мікроворсинки мікрофіламенти приєднуються до сітки з проміжних філаментів.

Мікротрубочки слугують рейками, вздовж яких за допомогою білків-моторів динеїну і кінезину здійснюється переміщення внутрішньоклітинних структур. Вважається, що таким чином мікротрубочки забезпечують протікання процесів екзоцитозу та ендоцитозу. Але внутрішньоклітинні структури можуть переміщуватись і вздовж мікрофіламентів. Це переміщення забезпечує інший білок-мотор - міозин. Мікротрубочки є основним компонентом аксонеми джгутиків та війок. Ці структури забезпечують переміщення клітин в просторі або переміщення якихось рідин відносно самих клітин. Мікрофіламенти ж забезпечують переміщення клітин за допомогою псевдоподій. Тобто, завдяки узгодженій роботі мікротрубочок та мікрофіламентів здійснюються різні внутрішньоклітинні рухи та переміщення самих клітин у просторі.

Під час поділу клітини мікротрубочки утворюють веретено поділу. За його допомогою відбувається розходження хромосом до полюсів. Актинові філаменти у тваринних клітинах в цей час разом з білком-мотором міозином формують актино-міозинове скоротливе кільце по екватору клітини. Це скоротливе кільце забезпечує розділення клітини на дві дочірні.

Під час ембріонального та постембріонального розвитку здійснюється переміщення клітин і цілих клітинних пластів, зміна їх форми і т.п.. Всі ці процеси також забезпечуються узгодженою роботою елементів цитоскелету. Наприклад, під час закладки нервової трубки (цей процес називається нейруляцією) клітини ектодерми на спинній частині зародка (тобто, клітини нервових валиків) спочатку стають вищими, а потім замикаються у трубку Показано, що збільшення висоти клітин відбувається через видовження мікротрубочок, які розміщуються паралельно апікально-базальній вісі клітини (див.рис. 5.16). Потім в апікальній частині клітини формується актино-міозинове скоротливе кільце, подібне до скоротливого кільця, яке формувалось під час поділу клітини. Завдяки скороченню цього кільця апікальна частина клітин звужується, клітини стають трапецієподібними. А оскільки цей процес відбувається узгоджено в усіх клітинах майбутньої нервової трубки, то це веде до замикання пласта клітин у трубку.

Клітини у складі багатоклітинного організму можуть бути з’єднаними між собою міжклітинними контактами. В утворенні деяких механічних міжклітинних контактів беруть участь мікрофілементи та проміжні філаменти. В десмосомі до плазмолем двох контактуючих клітин підходять проміжні філаменти. Тут ці філаменти взаємодіють з білками десмоплакінами, а останні з інтегральними глікопротеїдами плазмолеми десмогліїнами. Десмогліїни цих двох клітин з’єднуються між собою, забезпечуючи, по-суті, об’єднання проміжних філаментів двох сусідніх клітин між собою. Це дозволяє даним клітинам міцніше прикріпитись одна до одної. Подібну структуру має і так званий проміжний контакт, в якому контактують мікрофіламенти двох сусідніх клітин.

Таким чином, елементи цитоскелету формують єдину опорно-рухову систему клітини.

БІЛЕТ 16

43. Структура хроматину та регуляція транскрипції: роль позиціювання нуклеосом, посттрансляційних модифікацій гістонів та факторів ремоделювання хроматину в регуляції транскрипції.

Загальна довжина ДНК в ядрі еукаріотичної клітини – близько 2 м. Така кількість ДНК вимагає її щільної упаковки, яка зумовлює тотальне пригнічення функціональних активностей у більшій частині геному. Але при цьому упаковка ДНК у клітинному ядрі має дозволяти вибіркову активацію певних ділянок у певні моменти часу. Ці альтернативні завдання вирішуються завдяки тому, що ДНК існує в клітинному ядрі у вигляді складного нуклеопротеїнового комплексу – хроматину.

На першому рівні організації хроматину ДНК формує за рахунок взаємодії з білками елементарні утворення – нуклеосоми – із середньою щільністю одна нуклеосома на 200 пар основ. Білковий компонент нуклеосоми (кор) складається з 8 молекул корових гістонів Н2А, Н2В, Н3 та Н4 – по дві молекули кожного типу. На другому рівні компактизації за участю лінкерних гістонів Н1 утворюється так звана фібрила товщиною 30 нм. Хроматинова фібрила формує петлі розміром 20-200 тисяч пар основ, кінці яких є жорстко закріпленими на скелетних структурах ядерного матриксу.

Нуклеосома

Білковий компонент нуклеосоми (nucleosome) – гістони (histones), які є одним з найбільш еволюційно консервативних класів білків. Усі корові гістони (містять від 102 до 135 амінокислотних залишків) мають спільну схему будови. В первинній структурі виділяють дві частини: глобулярну та N-кінцеву невпорядковану (хвіст) довжиною від 20 (Н2А) до 40 (Н3) амінокислотних залишків. Гістон Н2А має також помітний С-кінцевий хвіст довжиною близько 15 залишків. Невпорядковані хвости практично не містять гідрофобних залишків, збагачені позитивно зарядженими амінокислотами і є субстратами для численних посттрансляційних модифікацій (див. нижче).

Глобулярна частина всіх корових гістонів, у свою чергу, також має спільну структуру. Вона виглядає як характерний триспіральний гістоновий мотив (histone fold), у якому одна довга α-спіраль фланкована двома короткими (див. рис. 3.16, а). Гістон Н3 містить також додаткову α-спіраль із боку N-кінця мотиву (αN-спіраль), а гістон Н2В – додаткову αС-спіраль. Гістоновий мотив не формує гідрофобного ядра, заекранованого від розчинника, – значна кількість гідрофобних залишків опиняється на поверхні. Внаслідок цього одна молекула корового гістона не може існувати як окремий глобулярний білок у водному середовищі. Мінімальними стабільними структурними одиницями є гетеродимери Н2А-Н2В та Н3-Н4 (мають подібну структуру, представлену на рис. 3.16, а). Два гістонових мотиви формують у складі димерів щільне гідрофобне ядро, а специфічність формування димерів залежить від наявності додаткових αN- та αС-спіралей у гістонах Н3 та Н2В відповідно.

На поверхні димера розташовані 3 зони скупчення позитивно заряджених амінокислотних залишків, які, за електростатичним механізмом, здатні взаємодіяти з ДНК. В межах кожного такого сайта знаходиться принаймні один залишок аргініну, що він відіграє найбільш важливу роль у взаємодії з ДНК. Разом ці три сайти створюють платформу для зв’язування ділянки ДНК довжиною 27-28 пар основ (~ 2,5 витка подвійної спіралі, рис. 3.16, а).

Два гетеродимери Н3-Н4 взаємодіють між собою за рахунок утворення чотириспірального пучка між гістоновими мотивами двох молекул Н3. У результаті формується тетрамер (Н3-Н4)2 – комплекс, який займає центральну позицію в структурі нуклеосоми (рис. 4.9). Структура тетрамера нагадує підкову, яка характеризується хіральністю – утворює елемент лівої спіралі. Вісь симетрії тетрамерного комплексу (яка водночас є і віссю симетрії всієї нуклеосоми) проходить через інтерфейс між двома молекулами Н3.

Аналогічний за своєю структурою чотириспіральний пучок між гістоновими мотивами молекул Н4 та Н2В служить для забезпечення взаємодій між тетрамером (Н3-Н4)2 та димером Н2А-Н2В. Таким чином, “підкова” тетрамера симетрично продовжується двома димерами Н2А-Н2В в обидва боки, результатом чого є утворення октамера (Н2А-Н2В-Н3-Н4)2. Отже, глобулярні частини гістонів утворюють октамерний комплекс, який і служить білковим кором нуклеосоми (рис. 4.10). На глобулярній поверхні октамера існує своєрідний трек позитивно заряджених амінокислотних залишків, який використовується для взаємодії з нуклеосомною ДНК довжиною 145 пар основ.

Окрема нуклеосома (нуклеосомна кор-частинка) – октамер гістонів + 145 пар основ ДНК – може бути вилучена з хроматину за допомогою мікрококкової нуклеази: ця нуклеаза робить дволанцюговий розріз у ДНК, і, оскільки один з ланцюгів нуклеосомної ДНК завжди взаємодіє з гістонами (рис. 4.10), доступною для нуклеази є лише ДНК за межами нуклеосоми. У хроматині вся ДНК формує нуклеосоми із середньою щільністю 1 нуклеосома на 200 пар основ, сусідні нуклеосоми з'єднані міжнуклеосомними лінкерними (linker) ділянками. Нуклеосомна ДНК + лінкерна ділянка складають так званий нуклеосомний повтор, довжина якого (середнє значення 200 пар основ) варіює як уздовж полінуклеосомного ланцюга, так і в залежності від функціонального стану, типу клітин тощо.

Вісь симетрії нуклеосоми проходить через центральну точку нуклеосомної ДНК, у якій великий жолобок подвійної спіралі є зверненим до поверхні октамера гістонів (рис. 4.10). ДНК-гістонові взаємодії здійснюються у позиціях, де маленький жолобок контактує з поверхнею октамера: саме тут реалізуються взаємодії ДНК із позитивно зарядженими сайтами на поверхні гістонових мотивів (порівн. рис. 3.16, а, 4.9, 4.10). Як продемонстровано на рис. 4.10, нуклеосомна ДНК є значно вигнутою на поверхні октамера гістонів і формує майже ідеальну ліву суперспіраль із радіусом 41,9 Å і кроком 25,9 Å. Центральні 133 пари основ такої суперспіралі дають 1,67 витка, решта нуклеосомної ДНК (дві ділянки по 7 пар основ на вході/виході) є практично прямою і просто продовжує хід нуклеосомної суперспіралі. Зрозуміло, що значний вигин нуклеосомної ДНК потребує енергетичних витрат, які компенсуються ДНК-гістоновими взаємодіями.

Структура нуклеосомної ДНК зумовлена її взаємодією із глобулярною частиною октамера гістонів. N-кінцеві хвости гістонів Н3 та Н2В виходять за межі нуклеосоми через канали, сформовані маленькими жолобками двох дуплексів сусідніх витків нуклеосомної суперспіралі (рис. 4.10). Ділянки хвостів, які безпосередньо розташовані в каналах, є позитивно зарядженими і, таким чином, додатково скріплюють сусідні витки суперспіралі. N-кінцеві хвости гістонів Н4 та Н2А також взаємодіють з маленьким жолобком зовні нуклеосомної суперспіралі. Особливе місце – входу/виходу нуклеосомної ДНК (рис. 4.10) – займає найбільш довгий N-кінцевий хвіст гістона Н3. Позитивно заряджений хвіст Н3 стабілізує структуру нуклеосоми в цій зоні, де спостерігається найвища щільність негативних зарядів ДНК.

Значна частина гістонових хвостів просто виходить за межі нуклеосоми. Завдяки своїй структурній лабільності вони приймають участь в організації хроматину на наднуклеосомному рівні, а також відіграють важливу роль платформи для зв’язування різноманітних білків, що залежить від посттрансляційних модифікацій хвостів (див. нижче).

Аналіз структури нуклеосоми та молекулярних механізмів її стабілізації дозволяє сформулювати наступні положення.

• Електростатичні взаємодії між ДНК та гістонами за фізіологічних умов є дуже міцними – остаточне руйнування нуклеосоми in vitro відбувається при концентрації солі 2 М. Тобто, за фізіологічних умов зв'язування гістонів з ДНК є необерненим (рівновага неможлива між зв'язаними та дисоційованими гістонами). Відповідно, хоча структура нуклеосоми відповідає мінімуму вільної енергії, цей мінімум неможливо досягти за розумний проміжок часу: гістони швидко та безладно зв'язуються з ДНК без подальшої дисоціації. Для реалізації рівноважних умов ДНК-гістонової взаємодії in vivo у хроматині існують проміжні акцептори гістонів, що виконують роль факторів збірки/руйнування нуклеосом. Ці акцептори мають спорідненість до гістонів трошки меншу, ніж спорідненість гістонів до ДНК (рис. 4.11), що й забезпечує можливість рівноважного обміну гістонами між ДНК та проміжними акцепторами із зсувом цієї рівноваги у бік ДНК-гістонових комплексів.

• Незважаючи на міцність ДНК-гістонових взаємодій, тимчасове їх порушення на кінцях нуклеосомної ДНК є можливим за фізіологічних умов: з одного боку, взаємодії на кінцевих ділянках є більш слабкими, ніж у центральній частині нуклеосомної ДНК; з іншого – висока щільність негативного заряду (контакт між сусідніми витками нуклеосомної суперспіралі) дестабілізує нуклеосому ДНК на виході з нуклеосоми. Це призводить до тимчасового часткового розкручування нуклеосомної ДНК на кінцях, що є одним з головних шляхів структурної динаміки нуклеосом.

• Наявність проміжних акцепторів гістонів призводить до можливості обміну димерами Н2А-Н2В між різними нуклеосомами: тимчасове видалення димерів є іншим важливим шляхом структурної динаміки хроматину.

• Незважаючи на те, що ДНК-гістонові взаємодії у нуклеосомі є неспецифічними щодо послідовності пар основ ДНК (електростатичні взаємодії між фосфатами ДНК та позитивними амінокислотними залишками), у хроматині спостерігається феномен переважного позиціювання нуклеосом відносно послідовності. Основною причиною позиціювання нуклеосом є здатність ДНК до деформацій, які супроводжують формування нуклеосоми і залежать від послідовності нуклеотидів(див. розділ 3). У результаті нуклеосома “обирає“ таку ділянку, де вигин ДНК потребує менших енергетичних витрат. Це призводить до важливих функціональних наслідків: диференційного експонування ділянок ДНК до дії регуляторних факторів (розділ 6).

• При функціонуванні хроматину виникає необхідність у змінах згаданого вище експонування/екранування певних ділянок ДНК – репозиціюванні нуклеосом. Міцність ДНК-гістонових взаємодій не дозволяє спонтанного зсуву нуклеосом вздовж ДНК, що зумовлює потребу в особливих АТР-залежних молекулярних пристроях, що здійснюють таке репозиціювання, – факторах ремоделювання хроматину (розділ 6), які також можуть виступати факторами збірки/руйнування нуклеосом.

Посттрансляційні модифікації гістонових хвостів

Невпорядковані хвости корових гістонів є субстратом для ковалентних посттрансляційних модифікацій, яким піддаються конкретні (такі, що мають конкретну позицію в складі поліпептидного ланцюга) амінокислотні залишки певного типу.

Основні типи цих модифікацій (рис. 4.12):

o Ацетилювання залишків Lys – перенос залишку оцтової кислоти (ацетату) на аміногрупу Lys. Реакція каталізується гістон-ацетилтрансферазами (HAT, Histone AcetylTransferase), різні їх типи мають певну специфічність щодо залишків-мішеней. Результатом реакції є зникнення позитивного заряду на залишку Lys (рис. 4.12). Ацетилювання є динамічною модифікацією: гістон-деацетилази (HD, Histone Deacetylase, позначаються також як HDAC) здійснюють відщеплення ацетатних залишків. Два типи ферментів-антагоністів підтримують певний динамічний гомеостаз ацетилювання/деацетилювання, зсунутий в той чи інший бік у певних ділянках хроматину.

o Метилювання залишків Lys та Arg – перенесення метильної групи (однієї чи двох) на аміногрупу Lys або на гуанідинову групу Arg, позитивний заряд при цьому залишається. Реакція каталізується гістон-метилтрансферазами (HMT, Histone MethylTransferase), кожна з яких абсолютно специфічна щодо залишку-мішені. На відміну від ацетилювання, метилювання є дуже стабільною у часі модифікацією. Метильовані гістони замінюються на неметильовані дуже повільно – імовірно, лише шляхом заміни на гістони, синтезовані de novo.

o Фосфорилювання залишків Ser – перенос фосфатного залишку на ОН-групу Ser. Реакція каталізується гістон-кіназою (HK, Histone Kinase), відщеплення фосфату – фосфатазою.

Конкретні залишки, що модифікуються, показані на рис. 4.13. Серед усіх модифікацій, лише про ацетилювання можна сказати, що воно чітко корелює з транскрипційною активністю: гіперацетильовані гістони присутні у активних ділянках хроматину, у репресованих підтримується деацетильований статус. Інші модифікації впливають на функціональний стан складніше: метилювання одного залишку може викликати репресію транскрипції, іншого (через кілька амінокислот від першого в тому самому хвості) – супроводжувати активацію; фосфорилювання H3-Ser10 корелює з активацією транскрипції, але також супроводжує гіперконденсацію хроматину при переході до мітозу.

Оскільки ацетилювання численних залишків Lys (рис. 4.13) призводить до суттєвого пониження позитивного заряду хвостів, лише ацетилювання може безпосередньо впливати на взаємодію хвостів з ДНК. Це не призводить до змін структури нуклеосоми (яка практично не залежить від хвостів), але змінює характер структурної динаміки як нуклеосоми, так і хроматинової фібрили на наднуклеосомному рівні її організації (див. нижче).

Проте, головним механізмом впливу модифікованих гістонових хвостів на функціональний стан хроматину є специфічне впізнання модифікованих хвостів іншими білками: регуляторами, факторами транскрипції, ферментами тощо. Так, ацетильовані залишки Lys впізнаються особливим структурним блоком таких білків – бромодоменом. Інший блок – хромодомен – впізнає метильовані Lys. Гістонові хвости використовуються як своєрідні платформи для збірки різноманітних білкових комплексів, і характер цієї збірки залежить від патерну модифікацій – розподілу певних модифікованих груп по хвостах. Співвідношення між патерном модифікацій та набором білків, який впізнає такий патерн, що, у свою чергу, має певні функціональні наслідки, називають гістоновим кодом.

Наприклад, фосфорилювання Н3-Ser10 із одночасним ацетилюванням Н3-Lys14 супроводжується активацією транскрипції, деацетилювання Н3-Lys14 із одночасним метилюванням Н3-Lys9 – репресією. Це лише невеличкий елемент такого коду: зрозуміло, що різноманітних комбінації модифікованих залишків на 8 гістонових хвостах (рис. 4.13) може бути велика кількість. Остаточне з'ясування гістонового коду ще далеко не завершено, певні його закономірності та інші приклади залучення гістонового коду до регуляції транскрипції наведені у розділі 6.

Гістон Н1

Одна молекула п’ятого гістона – лінкерного гістона Н1 – взаємодіє з кожною нуклеосомою в хроматині. Проте, ця взаємодія, на відміну від корових гістонів, є динамічною: спостерігається швидкий обмін лінкерних гістонів між хроматином та їхнім пулом у ядрі. За своєю структурою гістон Н1 (мономерний білок) суттєво відрізняється від корових гістонів (рис. 4.14). Молекула Н1 містить N-кінцевий невпорядкований хвіст, глобулярний домен GH1 та довгий, збагачений позитивно зарядженими залишкам (насамперед Lys) С-кінцевий хвіст довжиною приблизно 100 амінокислотних залишків (приблизно половина молекули). Глобулярний домен (приблизно 80 амінокислот) належить до так званої родини “спіральних із крильцем” (winged helix) ДНК-зв’язуючих білків.

На поверхні домену існують два можливих сайти взаємодії з ДНК, які формуються кластерами позитивно заряджених амінокислот і локалізовані на протилежних сторонах глобули. Відповідно, глобулярний домен взаємодіє з нуклеосомною ДНК на виході з нуклеосоми – імовірно, між двома сусідніми витками (рис. 4.15, а), додатково стабілізуючи нуклеосомну суперспіраль. Частинка, яка містить гістоновий октамер, близько 166 пар основ ДНК та гістон Н1, називається хроматосомою. С-кінцевий хвіст Н1 взаємодіє з обома лінкерами, що виходять з нуклеосоми. У результаті дві лінкерні ділянки (довжиною по 10-30 пар основ) утворюють стеблоподібну структуру на виході з нуклеосоми (рис. 4.15, б).

Наднуклеосомна упаковка хроматинової фібрили

У хроматині нуклеосоми з’єднані лінкерами довжиною ~50 пар основ. Якщо лінкер (у полінуклеосомному ланцюгу без гістона Н1) просто продовжує хід нуклеосомної ДНК по прямій, нуклеосоми у складі полінуклеосомної нитки мають бути розташовані зиґзаґом (рис. 4.16, а). Саме такий вигляд має декомпактизована (у відсутності Н1 та при низькій іонній силі) полінуклеосомна фібрила під мікроскопом (електронним чи атомно-силовим). Товщина такого зиґзаґу дорівнює приблизно 30 нм. Полінуклеосомний зиґзаґ може конденсуватися (рис. 4.16, б). Умова конденсації (необхідна, але недостатня) – фізіологічна іонна сила (крім одновалентних мають бути присутніми двовалентні катіони) для зниження електростатичного розштовхування між нуклеосомами. Фактор конденсації (її рушійна сила) – невпорядковані хвости корових гістонів: лабільні позитивно заряджені хвости ефективно “зшивають“ фібрилу, взаємодіючи з ДНК сусідніх нуклеосом.

У присутності гістона Н1 компактна хроматинова фібрила товщиною 30 нм стає значно більш стабільною. Ключова роль у цій стабілізації належить стеблу, що формується внаслідок взаємодії з гістоном Н1 двох лінкерних ділянок на виході з нуклеосоми: за рахунок стебла сусідні нуклеосоми значно зближуються, що сприяє конденсації (рис. 4.17). Таким чином, присутність Н1 наближає нуклеосоми одна до одної у складі фібрили, чим сприяє “зшиванню“ цих нуклеосом хвостами корових гістонів. І навпаки, компактизація фібрили за участю хвостів корових гістонів сприяє зв'язуванню Н1 із наближеними у просторі ділянками лінкерів.

Отже, суперструктура конденсованої фібрили товщиною 30 нм являє собою тривимірний зиґзаґ нуклеосом, з’єднаних практично прямими без вигинів лінкерами, які спрямовані всередину фібрили. Всередині знаходяться також і гістони Н1; сумісна дія Н1 та хвостів корових гістонів підтримує компактний стан фібрили.

Фібрила товщиною 30 нм – основна форма існування інтерфазного хроматину. Але у хроматині існує значна гетерогенність за ступенем конденсації. З одного боку, передумовою активації окремих ділянок хроматину є деконденсація фібрили. Факторами такої деконденсації є зниження спорідненості до ДНК хвостів корових гістонів унаслідок їх ацетилювання (зниження позитивного заряду) та тимчасова дисоціація Н1. Дисоціації Н1 сприяє ацетилювання хвостів корових гістонів, а також посттрансляційні модифікації самого Н1 (зокрема, фосфорилювання). Деконденсація фібрили та дисоціація Н1 створюють можливість взаємодії з ДНК різноманітних негістонових білків, що в решті решт і призводить до активації транскрипції (див. розділ 6).

З іншого боку, у репресованих ділянках хроматинова фібрила може бути як додатково стабілізованою у компактному стані, так і піддаватися компактизації більш високого порядку. Частина хроматину, що зберігає стан підвищеної компактизації протягом інтерфази називається гетерохроматином (решта хроматину, де в принципі може відбуватися активація транскрипції, позначається як еухроматин). Утворення гетерохроматину відбувається, головним чином, у ділянках, що містять повтори – у центромерах, теломерах, зонах концентрації мобільних елементів. Деталі структури гетерохроматину залишаються нез'ясованими, механізми встановлення та підтримання неактивного конденсованого стану гетерохроматину розглядаються у розділі 6.

Петлеві домени хроматину та ядерний матрикс

На наступному рівні структурної організації у клітинному ядрі хроматинова фібрила формує петлі, кінці яких є жорстко закріпленими на скелетних структурах клітинного ядра – ядерному матриксі (рис. 4.18). Оскільки основи петлі фіксуються на матриксі, ДНК у складі петлі має топологічні обмеження, тобто є еквівалентною до циркулярної (див. розділ 3). Одна петля, що містить від 20 до 200 тисяч пар основ ДНК (один або кілька генів) часто розглядається як важливий елемент регуляції процесів транскрипції та реплікації.

З білками матриксу взаємодіють ділянки ДНК довжиною від 3 до 1000 пар основ – ділянки, асоційовані з матриксом (MAR, Matrix Associated Regions). Вони не мають між собою гомології щодо послідовності, часто збагачені на АТ-пари. Вважається, що більшість функціональних процесів, які відбуваються на ДНК, розпочинається саме на матриксі, тобто на MAR.

Ядерний матрикс – це система білкових філаментів, яка формує структурний каркас ядра. На периферії ядра розташована особлива частина матриксу, асоційована з внутрішньою ядерною мембраною – ядерна ламіна. Філаменти ламіни протягнуті від однієї ядерної пори до іншої і позиціонують порові комплекси у площині мембрани. Подвійна ядерна мембрана, ядерні пори та ламіна утворюють єдину систему – ядерний конверт. Від ламіни всередину ядра протягнуті філаменти внутрішнього ядерного матриксу. З ламіною взаємодіє значна частина гетерохроматину, зокрема центромери та теломери хромосом. Еухроматинова частина хромосоми “звішується“ всередину ядра, де хроматинові петлі закріплюються на внутрішній частині матриксу. В результаті хромосома займає певну зону в об'ємі ядра – хромосомну територію.

Все сказане вище стосується організації хроматину та хромосом в інтерфазному ядрі. Коли клітина вступає до мітозу, після реплікації ДНК починається утворення надкомпактної мітотичної хромосоми, деталі структурної організації якої залишаються недостатньо зрозумілими. Одночасно з компактизацією хроматинової фібрили частина ламіни “розчиняється“ разом з ядерною мембраною, інша частина, разом з внутрішнім матриксом, перебудовується з утворенням білкового каркасу мітотичної хромосоми – хромосомного скефолду (scaffold), з яким залишаються зв'язаними основи хроматинових петель.

Доступність промоторів

Залежне від послідовності ДНК переважне позиціювання нуклеосом (розділ 4) призводить до диференційного експонування ділянок ДНК до дії регуляторних факторів. З одного боку, будь-яка послідовність пар основ диктує певний “передвстановлений“ розподіл нуклеосом. З іншого боку, активація промоторів призводить до їх збіднення на нуклеосоми або за рахунок репозиціювання, або внаслідок тимчасового видалення гістонів. Таке збіднення на нуклеосоми проявляється, зокрема, у підвищенні чутливості промоторної ДНК до нуклеаз.

Рис. 6.15 ілюструє детально досліджений приклад: присутність нуклеосом у промоторі дріжджового гена PHO5, вивчену Корнбергом зі співавторами (Roger D. Kornberg). У неактивному стані промотор містить 3 нуклеосоми у специфічних позиціях, у межах однієї знаходиться ТАТА-бокс, іншої – специфічна регуляторна послідовність. При активації промотора (цьому передує гіперацетилювання гістонів) спостерігається втрата нуклеосом в усіх трьох сайтах, але ця втрата не є повною в жодному з них. У середньому втрачається 1,9 нуклеосоми з трьох; кожна з нуклеосом від 0,18 до 0,6 (специфічно для певної нуклеосоми) частини часу зберігається в активному промоторі. Тобто при активації здійснюється певна рівновага між видаленням та реформуванням нуклеосом.

Тимчасове видалення нуклеосом з активних промоторів є загальним правилом. Тотальний аналіз розподілу нуклеосом по ділянках усього геному дріжджів вказує, що цей розподіл є нерівномірним:

– у міжгенних зонах щільність нуклеосом зменшена у порівнянні з відкритими рамками зчитування;

– регуляторні області, зокрема, промотори, містять менше нуклеосом, ніж інші міжгенні зони;

– існує зворотна кореляція між щільністю нуклеосом у промоторах та рівнем транскрипційної активності відповідних генів.

Комплекси ремоделювання хроматину

Підвищення доступності промоторів при їх активації потребує спеціальних механізмів. Справа в тому, що за фізіологічної іонної сили електростатичні взаємодії ДНК та гістонів є дуже міцними, і нуклеосома зберігає високу стабільність. Ця стабільність практично виключає навіть трансляційні переміщення нуклеосоми вздовж ДНК (слайдинг). У зв’язку з тим, що взаємне розташування ДНК і октамера гістонів є жорстко детермінованим (розділ 4), переміщення нуклеосоми потребує появи високоенергетичних інтермедіатів (часткова дисоціація ДНК або її прокрутка по поверхні октамера – зміна твіста). Оскільки переміщення нуклеосом є необхідним для експонування регуляторних сайтів на ДНК до дії транскрипційних факторів, у клітині існує спеціальна система, що сприяє репозиціюванню нуклеосом за рахунок індукування проміжних структурних станів: АТР-залежні комплекси ремоделювання хроматину (chromatin remodeling complexes).

На сьогодні описано велику кількість таких комплексів у дріжджів, комах і ссавців. Усі комплекси ремоделювання (КР) – мультибілкові комплекси досить великої молекулярної ваги – містять у своєму складі субодиницю, що має АТР-азну активність. Власне АТР-азний домен є дуже подібним для усіх комплексів і має високу гомологію з ДНК-геліказами. У залежності від наявності додаткових структурних доменів різного типу в складі каталітичної субодиниці, КР розділяють на три групи:

1) Swi/Snf (Switch/Sucrose non-fermenting – назва походить від першого описаного КР цієї родини, який було відкрито як групу мутацій дріжджів з певними біохімічними проявами) – комплекси складаються з 10-15 субодиниць, каталітична субодиниця містить бромодомен, під час дії комплексу спостерігаються різноманітні проміжні структурні форми нуклеосом;

2) ISWI (Imitation SWItch) – 4-5 субодиниць, індукують слайдинг нуклеосом без масштабних змін їхньої структури;

3) CHD (Chromodomain Helicase DNA binding) – містять хромодомен та гістон-деацетилазу, тісно пов’язані з перебудовами хроматину в репресованих ділянках.

Крім того, є низка комплексів, що не вкладаються у цю класифікацію. КР здатні здійснювати численні взаємодії з нуклеосомною ДНК, гістоновими хвостами, специфічними та загальними факторами транскрипції, гістон-ацетилтрансферазами тощо. При взаємодії з нуклеосомою КР та нуклеосома чітко орієнтуються відносно одне одного: принаймні, КР родини Swi/Snf оточують нуклеосому, зв'язуючи її всередині глибокої порожнини.

Основний результат активності всіх комплексів ремоделювання – трансляційне репозиціювання нуклеосом. Крім того, комплекси родини Swi/Snf можуть індукувати перенос октамера гістонів з однієї ділянки ДНК на іншу або з ДНК на проміжні акцептори гістонів (див. розділ 4).

Механізм дії комплексів ремоделювання базується на гомології з ДНК-геліказами. Незважаючи на таку гомологію, АТР-азна субодиниця КР не здатна діяти як геліказа – розводити два ланцюги. Подібно до геліказ, комплекси ремоделювання, використовуючи енергію гідролізу АТР, пересуваються вздовж ДНК, але без її руйнування. Така транслокація має бути пов’язана з одночасним обертанням ферменту навкруг подвійної спіралі, або навпаки – прокруткою спіралі через фермент. Оскільки КР при цьому зафіксований на нуклеосомі, тобто взаємне обертання комплексу і нуклеосоми є неможливим, рух комплексу в бік від нуклеосоми буде генерувати торсійну напругу (зміну твіста), штовхаючи ДНК усередину нуклеосоми (рис. 6.16). Такий сценарій роботи комплексів ремоделювання розглядається сьогодні як найбільш імовірний.

Напруга, яка створюється за рахунок транслокації комплексу ремоделювання, може трансформуватися в зміну твіста в межах кінцевої ділянки нуклеосомної ДНК. Локальна зміна твіста буде дифундувати всередину нуклеосоми, результатом чого буде прокрутка подвійної спіралі по поверхні октамера гістонів, тобто, в решті решт, зміна його трансляційної позиції (рис. 6.17). При такому механізмі переміщення шляхом твістинга (twisting) не повинно спостерігатися великих змін в структурі нуклеосоми під час її пересування. Саме це й характерно для комплексів ремоделювання типу ISWI.

Комплекси ремоделювання родини Swi/Snf здатні генерувати проміжні стани нуклеосоми, в яких ДНК є більш доступною для нуклеаз, за рахунок формування петлі ДНК на поверхні октамера гістонів. Отже, на відміну від попереднього механізму, для комплексів Swi/Snf напруга, що є результатом транслокації, викликає випетлювання (bulging) нуклеосомної ДНК. Така петля ймовірно формується на кінцевій ділянці ДНК у нуклеосомі і далі пересувається по поверхні октамера, що призводить, знов, до зміни позиції нуклеосоми (рис. 6.17).

Проміжні метастабільні стани нуклеосоми з випетлюванням ДНК можуть відігравати важливу функціональну роль самі по собі, оскільки вже можуть забезпечувати зростання доступності нуклеосомної ДНК: експонування ДНК петлі створює умови для її “захоплення“ транскрипційними факторами. Крім того, значна дестабілізація ДНК-гістонових взаємодій у проміжному стані з випетлюванням значно підвищує імовірність руйнування нуклеосоми: у присутності Swi/Snf продемонстровано перенос гістонів на іншу ділянку ДНК або на проміжні переносники гістонів.

Обидва описані механізми дії комплексів ремоделювання розпочинаються з ділянки ДНК на вході до нуклеосоми. Відповідно, ця ділянка має бути вільною від гістона Н1: Н1 і КР конкурують між собою за зону входу/виходу нуклеосомної ДНК.

Шляхи рекрутування комплексів ремоделювання до промоторів. Насправді функціональні наслідки ремоделювання хроматину певним комплексом можуть бути різноманітними. Серед відомих на сьогодні комплексів ремоделювання, лише один – NuRD (Nucleosome Remodeling and Deacetylation), представник родини CHD – працює виключно як корепресор. Дія інших комплексів ремоделювання призводить або до репресії, або до активації у залежності від контексту інших функціонально важливих впливів, у кооперації з якими працює даний комплекс.

У випадку активації система АТР-залежного ремоделювання хроматину завжди працює кооперативно із системою ацетилювання гістонів. Реалізуються різноманітні стратегії рекрутування КР до промоторів:

• За рахунок взаємодії КР з транскрипційними факторами. Активація ініціюється ТФ, який впізнає невеликий сайт зв'язування на ДНК (навіть на поверхні нуклеосоми) і безпосередньо рекрутує комплекс ремоделювання, або КР рекрутується пізніше на стадії збірки енхансосоми іншими ТФ. Після цього, як правило, до енхансосоми рекрутується гістон-ацетилтрансферазний комплекс.

• За рахунок впізнання ацетильованих Lys бромодоменом, що входить до складу КР. Один з прикладів, який поєднує цей та попередній шляхи рекрутування КР, представлено на рис. 6.18: невеликий транскрипційний фактор зв'язується у промоторі та рекрутує гістон-кіназу; кіназа здійснює фосфорилювання Ser-10 гістона Н3 та дисоціює; фосфорильований Ser-10 та транскрипційний фактор впізнаються гістон-ацетилтрансферазою, відбувається ацетилювання лізинів; ацетильовані Lys та ТФ рекрутують SWI/SNF (комплекс, що належить до родини Swi/Snf), який, здійснюючи репозиціювання нуклеосоми, звільняє ТАТА-бокс; відбувається зв'язування TFIID і збірка преініціаторного комплексу. Інший приклад див. нижче на рис. 6.19.

• За рахунок взаємодії з білками ядерного матриксу (див. розділ 4), які, таким чином, можуть рекрутувати комплекс ремоделювання до основи хроматинової петлі – до ділянок, асоційованих з матриксом (MAR). Така ділянка часто використовується як своєрідні “вхідні ворота“ для факторів, що забезпечують регуляцію активності у межах петлі, де міститься один або кілька генів.

• За рахунок впізнання метильованих Lys хромодоменом, що входить до складу КР родини CHD. Комплекси цієї родини містять також структурні модулі, здатні впізнавати метильовані цитозини (5mC) у ДНК.

Таким чином, комплекси ремоделювання хроматину інкорпоровані у загальну систему регуляції транскрипції і працюють у тісній кооперації з транскрипційними факторами та системою посттрансляційних модифікацій гістонів.