1.1.4.Кооперативное связывание лигандов

Рис. 4.8 Зависимость формы графика Скетчарда от типа связывания: 1 — один тип независимых связывающих центров (некооперативное связывание; 2 — два типа независимых связывающих центров (некооперативное связывание или один тип связывающих центров с отрицательной кооперативностью связывания; 3 — один тип связывающих центров с положительной кооперативностью

Выше уже говорилось о кооперативном связывании лигандов, когда для биополимеров, имеющих несколько идентичных связывающих мест, присоединение первого лиганда либо затрудняет (отрицательная кооперативность), либо облегчает (положительная кооперативность) присоединение второго и так далее. Для предварительного выяснения типа связывания полезным является построение графика Скетчарда. Как видно из Рис. 4 .8 линейный график Скетчарда (1) свидетельствует о наличие в биомолекуле лишь одного типа независимых связывающих мест (некооперативное связывание). Вогнутая кривая (2) может наблюдаться в двух случаях. Либо при некооперативном связывании, тогда она указывает на наличие двух типов мести связывания, либо при связывании с отрицательной кооперативностью. Выбор между этими моделями невозможно сделать только на основе данных по связыванию. В противоположность этому, выпуклая кривая (3) однозначно указывает на положительную кооперативность связывания.

Отрицательная кооперативность встречается относительно редко. В то же время, положительная кооперативность играет важную роль во многих биологических процессах.

Полуэмпирическая модель Хилла

Влияние кооперативности связывания кислорода гемоглобином (сплошная кривая) на эффективность переноса кислорода от легких к тканям (пунктиром представлена рассчитанная кривая насыщения для некооперативного связывания).

При анализе кооперативного связывания лиганда часто используют полуэмпирический подход для определения параметров связывания, а затем объясняют их физический смысл. Модель Хилла основана на предположении, что связывание первого лиганда настолько повышает к лиганду сродство остальных связывающих мест, что это приводит к насыщению всех связывающих центов (бесконечная степень кооперативности, принцип «все или ничто»). Следовательно, в системе присутствует либо свободный полимер P, либо полимер с полностью занятыми связывающими центрами PL_n, где n — число связывающих мест.

( 4.0)

Константа такого равновесия равна:

( 4.0)

Размерность константы М^–n. Концентрация свободного полимера [P] = [P]_o – [PL_n]. При избытке лиганда [L]  [L]_o. Теперь выражение для концентрации комплекса [PL_n] запишется в виде:

( 4.0)

Рис. 4.9 Зависимость степени насыщения связывающих центров от степени кооперативности _H. При _H = 1 кооперативность отсутствует.

Поскольку каждая из молекул биополимера имеет n связывающих центров, то общая концентрация связывающих мест [P]_o·n, а концентрация комплекса имеет смысл числа занятых связывающих мест, то выражение для изотермы связывания принимает следующий вид:

( 4.0)

Уравнение выведено в предположении бесконечно высокой степени кооперативности. В действительности такая кооперативность не обнаружена. Что бы использовать модель Хилла для описания реальных систем вводят эмпирический коэффициент _H. Теперь выражение для кривой связывания приобретает окончательный вид:

,

( 4.0)

где 1  _H  n. Параметр _H называю коэффициентом Хилла; он является характеристикой кооперативности. Когда _H = n, система ведет себя как идеально кооперативная, если _H = 1, кооперативность отсутствует. На Рис. 4 .9 представлены кривые насыщения связывающих центров лигандом в зависимости от величины коэффициента Хилла.

Видно, что с увеличением степени кооперативности кривые становятся все более S‑образными и крутизна их возрастает.

Модель Хилла равно применима и для мономерных биополимеров, и для олигомеров, состоящих из нескольких субъединиц. Из олигомерных объектов особый интерес представляет гемоглобин, осуществляющий перенос кислорода от легким к тканям организма и обратный перенос углекислого газа. Эта молекула состоит из четырех субъединиц, с каждой из которых связана молекула гема. Именно гем и выполняет функции связывающего центра (всего четыре связывающих места). Связывание кислорода происходит высоко кооперативно, так что связывание первой молекулы кислорода резко повышает сродство остальных центров к кислороду и т.д.

Рис. 4.10. Сравнение эффективности транспорта кислорода из легких в ткани кооперативной (сплошная кривая) и некооперативной (пунктир) системами

Возникает вопрос: как влияет кооперативность связывания кислорода гемоглобином на его биологическую функцию? Ответ на этот вопрос иллюстрирует Рис. 4 .10. Видно, что в кооперативной системе гемоглобин в легких насыщается кислородом на 98% и отдает в тканях 63% запасенного кислорода. В то же время, если бы система работала как некооперативная, то гемоглобин насыщался бы лишь на 78% и отдавал тканям всего 21% кислорода. Таким образом, кооперативность связывания кислорода втрое повышает эффективность транспорта кислорода.

Симметричная модель с согласованным переходом

Промежуточное положение между упрощенной моделью Хилла и строгим рассмотрением многоступенчатых равновесий занимает симметричная модель Моно, Уаймена и Шанже. В основу модели положено предположение о сохранении симметрии биополимера во время конформационного перехода: в каждой частице биополимера все субъединицы находятся либо в форме R, либо в форме T. В этом случае поведение системы описывается всего тремя параметрами — константами соответствующих равновесий K, K_R и K_T, выражения для которых приведены выше (Раздел , Уравнения ( 4 .0)и ( 4 .0)). Эта модель учитывает положение, что конформационные изменения, вызываемые присоединением лиганда, происходят вследствие его влияния на уже существующее равновесие между двумя конформерами биополимера. Схематически модель представлена на Рис. 4 .11.

Хотя эта модель и была предложена специально для описания связывания кислорода гемоглобином, она равно может быть использована для описания поведения систем с другим числом мест связывания (другим числом субъединиц).

Из схемы на Рис. 4 .11 видно, что микроскопические константы образования комплекса с лигандом как для конформера T, так и для конформера R не зависят от степени заполнения лигандом связывающих центров. От степени заполнения зависят только константы конформационного равновесия. В то же время на макроскопическом уровне кажущаяся константа связывания второго лиганда больше константы связывания первого. Чтобы прояснить это кажущееся различие, выразим кажущиеся параметры через микроскопические константы. Для простоты рассмотрим модель лишь с двумя связывающими центрами.

Рис. 4.11 Схематическое изображение модели согласованных переходов для биополимера, состоящего из четырех субъединиц

Поскольку конформеры очень быстро взаимопревращаются и их физико-химические свойства различаются незначительно, экспериментально не удается измерить концентрацию каждого из конформеров в отдельности, но лишь их суммарную концентрацию, так что [P] = [T] + [R], [PL] = [TL] + [RL] и [PL₂] = [TL₂] + [RL₂]. Таким образом, на макроскопическом уровне мы вынуждены описывать систему следующими кажущимися равновесиями:

( 4.0)

( 4.0)

и интересующее нас отношение кажущихся констант равновесия:

( 4.0)

Выразив входящие в Уравнение ( 4 .0) концентрации через [T] и микроскопические константы равновесия, получим:

Рис. 4.12. Зависимость экспериментально наблюдаемой степени положительной кооперативности от отношения микроскопических констант конформационных равновесий при различных значениях K

( 4.0)

Нетрудно показать, что при K_R/K_T = 1 (лиганд связывается с конформерами R и T с одинаковой прочность) отношение кажущихся констант так же равно 1 (т.е. связывание некооперативно). С другой стороны

( 4.0)

Таким образом, при K < 1 и K_R/K_T > 1 отношение эффективных констант всегда будет больше 1, т.е. экспериментально мы будем наблюдать усиление связывания второй молекулы лиганда по сравнению с первой (положительная кооперативность). Графически эта зависимость представлена на Рис. 4 .12.

Видно, что степень кооперативности (усиление связывания второй молекулы лиганда по сравнению с первой) увеличивается с уменьшением K и увеличением отношения K_R/K_T.