Задачи и вопрoсы
1.Дана последовательность ДНК:
5’-A T C G C C G C A A C G A G A C G A C T G C G C A T C G T C T C G T T G C G – 3’
3’- T A G C G G C G T T G C T C T G C T G A C G C G T A G C A G A G C A A C G C - 5’.
В ходе ПЦР будет использоваться праймер со следующей последовательностью 5’-C G C A A C G A G A C-3’. Установите длину ампликона.
2. В ходе этапа выделения было получено ДНК 888 клеток. Был подобран праймер, который обусловливает амплификацию фрагмента ДНК длиной 500 п. н. Достаточно ли 29 циклов ПЦР для визуальной детекции данного фрагмента?
3. Дана последовательность ДНК:
5’-A T G C G G C A T T G G A G A C T C T C T G A G C A C T G C G C A T C G C A A -3’
3’-T A C G C C G T A A C C T C T G A G A G A C T C G T G A C G C G T A G C G T T -5’.
В ходе ПЦР могут быть использованы следующие праймеры:
а. 5’-G C G G C A T T G G-3’,
б. 5’-G A C T C T C T G A-3’,
в. 5’-T T G C GA T G C G-3’,
г. 5’-A G A C T C T C T G-3’.
Отжиг каких пар праймеров даст продукты амплификации? Какой длины будут ампликоны, если смешать все праймеры?
4. Если бы Кэри Мюллис в 1983 году (25 декабря) запустил амплификацию одного фрагмента ДНК из одной клетки эпителия кожи, то сколько бы копий ампликона наработалось к сегодняшнему дню? Скорость ПЦР – 1 цикл в день.
5. В ходе ПЦР было получено 7 фрагментов разной длины. ДНК было выделено из 7 клеток. Использовался только один тип праймера. Сколько раз отжегся праймер в первом цикле ПЦР?
Сколько раз отжегся праймер во втором цикле ПЦР?
6. В ходе ПЦР образуется 1 фрагмент ДНК. ДНК была выделена из одной клетки. Полимеразная цепная реакция была прервана во время стадии денатурации ДНК 9-го цикла. Насколько уменьшилось количество свободных молекул праймера?
8. Во время детекции продуктов амплификации можно видеть, что некоторые ампликоны имеют разную толщину. Почему?
9. Почему для проведения ПЦР нельзя использовать
ДНК-полимеразу человека, растительное масло, обычную воду?
10. В ходе ПЦР амплифицируется 1 ДНК-фрагмент. ПЦР была прервана на 35 цикле (III стадия). В ходе ПЦР используется праймер 5’-C A T C A T C A T -3’. Какой будет длина ДНК-фрагмента, если объединить все молекулы праймера, которые успели отжечься к этому моменту?
11. Сколько нужно молекул праймера, чтобы амплифицировался 1 фрагмент ДНК в течение 26 циклов?
12. В составе генома человека приблизительно 3,2 миллиарда пар нуклеотидов. В ходе ПЦР амплифицируется фрагмент ДНК длиной 512 п.н. Сколько понадобится циклов ПЦР, чтобы сумма двухцепочечных ампликонов по количеству п. н. стала в 7 раз больше, чем геном человека?
Краткий словарь терминов и дополнительные сведения
А
абиотические факторы – факторы неживой природы (свет, влажность и т. д.)
агароза – линейный полисахарид, получаемый из клеточных стенок некоторых родов (например, род Gelidium) красных и бурых водорослей; обладает ярко выраженным свойством к формированию гелей, точка образования геля – 45оС
анод – положительный полюс источника питания
ампликон – фрагмент ДНК, образующийся в ходе ПЦР
амплификатор программируемый – прибор, в котором проводят ПЦР
амплификация ДНК – многократное увеличение числа копий ДНК
Б
биотические факторы – факторы живой природы (микроорганизмы, растения и т. д.)
бромистый этидий – химическое вещество, способное встраиваться в двухцепочечную ДНК и флуоресцировать под ультрафиолетовыми лучами; канцероген; химическая формула – C21H20BrN3
В
водородные связи – электростатическое взаимодействие атома Н, связанного с сильно электроотрицательным элементом, с другими атомами
вортекс – центрифуга, имеющая воронку со смещенным центром тяжести для размешивания веществ
Г
геликаза – фермент, участвующий в процессе репликации, разрывает водородные связи между комплементарными основаниями в ДНК
ген – определенная последовательность ДНК, в которой закодирована первичная структура определенного белка или последовательность определенной молекулы РНК
Д
детекция – обнаружение
денатурация ДНК – явление, сопровождающееся разрывом водородных связей между комплементарными основаниями в ДНК под воздействием высокой температуры
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота; структурой единицей ДНК является нуклеотид, состоящий из гетероциклического основания (аденина, гуанина, тимина либо цитозина), углевода дезоксирибозы и пирофосфорной кислоты
З
затравка – см. праймер
К
канцероген – вещество, способное вызывать раковые заболевания
катод – отрицательный полюс источника питания
ковалентная связь – химическая связь, образованная при помощи общей электронной пары атомов; сильная химическая связь
комплементарность гетероциклических оснований в ДНК (правило Чаргаффа) – в двухцепочечной молекуле ДНК количество молекул аденина равно количеству молекул тимина, а количество молекул гуанина равно количеству молекул цитозина
константа – постоянная величина
Л
лигаза – фермент, участвующий в процессе репликации; сшивает между собой участки ДНК, используя энергию гидролиза АТФ
лизирующий раствор – раствор, используемый в этапе выделения ДНК, для разрыва мембран в клетках (цитоплазматической, ядерной и т. д.); при выделении ДНК используется, например, раствор гуанидин тиоцианата
М
минеральное масло – масло, полученное химическим путем (например, из нефти); не содержит молекул ДНК
маркер молекулярных весов ДНК-фрагментов – фрагменты ДНК определенной длины
модификация – видоизменение
Мюллис Кэри – американский ученый, в 1993 году за изобретение ПЦР был удостоен Нобелевской премии в области химии
Н
нуклеотидтрифосфаты – элементарные строительные единицы ДНК (например, тимидинтрифосфат), используемые полимеразой в репликации
О
отжиг праймера – комплементарное образование водородных связей праймера с определенным участком ДНК
отмывочный раствор – 75% раствор этанола, используемый на стадии выделения ДНК для отмывки осадка, содержащего ДНК, от других веществ
П
палиндромы – участки одноцепочечной ДНК, содержащие одинаковую последовательность как от 5’ к 3’ концу, так и от 3’ к 5’ концу (например, 5’ATGCAAGAGAACGTA3’)
полимераза – фермент, участвующий в репликации, синтезирует комплементарную копию одноцепочечной молекулы ДНК
праймер – олигонуклеотид (10 – 30 п. н.), который, отжигаясь на определенном участке, помогает ДНК-полимеразе начать синтез комплементарной копии одноцепочечной молекулы ДНК
ПЦР – полимеразная цепная реакция, в которой количество двухцепочечного фрагмента (фрагментов) определенной длины увеличивается по математической формуле: 2(2n-1 - n) = F, где n- количество циклов ПЦР, а F – количество фрагментов
Р
радиационное излучение - включает α (атомные ядра гелия) и β частицы (быстрые электроны) и γ-лучи (длина волны около 0,01 Å), обладающие высокой энергией и высокой проникающей способностью
рентгеновские лучи – вид электромагнитного излучения с длиной волны 0,05–20 Å; обладают высокой энергией и высокой проникающей способностью
репликация – процесс удвоения ДНК
ресуспендирование – переход осадка раствора во взвешенное состояние
С
сайт нуклеотидный – участок ДНК с определенной нуклеотидной последовательностью
секвенирование – определение нуклеотидной последовательности ДНК (РНК)
сорбент – материал, обладающий сродством к определенным химическим веществам; при выделении ДНК, например, используются стеклянные бусы
стерилизация – обеззараживание, обеспложивание, уничтожение микроорганизмов в разных объектах с помощью физических и химических факторов
сульфат магния – MgSO4; ионы магния необходимы для работы ДНК-полимеразы
супернатант – надосадочная жидкость
Т
Тaq-полимераза – полимераза, выделенная из бактерий Thermis aquaticus; устойчива к высоким температурам
теломеры – концевые участки хромосом
термостат – электрический прибор, устанавливающий и фиксирующий температуру
топоизомераза – фермент, участвующий в процессе репликации ДНК; раскручивает спирализованную цепь ДНК
трис-боратный буфер – буфер, содержащий борную, кислоту, ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), трис-(оксиметил) - аминометан и бромистый этидий
У
ультрафиолетовые лучи – электромагнитное излучение с длиной волны от 20 до 3750 Å); обладают высокой энергией
Ф
флуоресценция – свечение вещества при освещении его светом
фрагмент Оказаки – см. праймер
Х
хромосома – компактное спирализованное состояние комплекса ДНК и белков-гистонов
Э
электрофорез – процесс движения в электрическом поле катионов к катоду, а анионов к аноду
элюция – экстракция, вымывание
эпителий – покровная ткань
Список рекомендуемой и цитируемой литературы
1. Кокаева З.Г., Коновалов Ф.А., Кузнецова О.И., Гостимский С.А. Использование ДНК-маркеров в исследовании полиморфизма геномов культурных растений. – М: Макс Пресс, 2006. – 60 с.
2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. – М.: Мир. – 1984.
3. Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Зинченко В.В. Анализ полиморфизма ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции. – М: Макс Пресс, 2006. – 80 с.
4. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Methods Enzymol. – 1987 – V. 155. – P. 335–350.
5. Sambrook J., Fritisch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: Laboratory Manual. – New York: Cold Spring Harbour Univ. Press. – 1989.
Адреса рекомендуемых веб-сайтов
1. www.molbiol.ru
2. http://en.wikipedia.org/wiki/Ethidium
3. http://www.lytech.ru
4. http://www.pcr-rus.narod.ru
5. http://www.karymullis.com
6. http://almaz.com/nobel/chemistry/1993a.html
7. http://www.pcr.ru/bibliogr/how_pcr/how_pcr.htm
Автор выражает благодарность коллегам Кокаевой Зареме Григорьевне и Компанийцеву Алексею Алексеевичу, которые оказали содействие в составлении методического пособия.
По вопросам о ПЦР-методе можно обращаться на e-mail автора: genepcr@mail.ru
Методические рекомендации к применению ПЦР-метода
для студентов 5 курса дневной формы обучения
специальности 8. 070402
«биология»
образовательно-квалификационного уровня «магистр»
профессионального направления подготовки