Вопрос 26

Реакция связывания комплемента

Эта реакция основана на законе, общем для всех реакций иммунитета: в случае

взаимодействия иммунной сыворотки со специфическим антигеном при наличии

комплемента образующийся комплекс антиген+антитело обязательно адсорбирует

(связывает) комплемент. В случаях же отсутствия специфического сродства между

антигеном и антителами сыворотки образования комплекса антиген + антитело не

происходит и комплемент остается свободным. Процесс адсорбции комплемента при

положительной реакции антитела с антигеном остается невидимым. Для того чтобы

установить, произошла ли адсорбция комплемента или он остался свободным

(несвязанным), в реакцию вводят вторую систему (гемолитическую), в свою очередь

состоящую из антигена (эритроцитов) и специфической (гемолитической) сыворотки. При

наличии свободного комплемента наступает гемолиз. Отсутствие гемолиза будет

свидетельствовать о недостатке комплемента, необходимого для выявления реакции

лизиса, в силу абсорбции его в первой части реакции (рис. 12)

РСК, как и другие серологические реакции, можно использовать для выявления

специфических АТ по известному АГ, а также для определения АГ по известным АТ.

Реакция связывания комплемента проводится в два этапа при участии двух

систем:

1) первая система — антиген+ антитело +комплемент — обусловливает связывание

(адсорбцию) комплемента в том случае, если антитело соответствует антигену. В случае же

несоответствия антитела и антигена комплемент остается свободным;

2) вторая система— специфическая гемолитическая сыворотка + соответствующие

эритроциты — является индикатором,

ПОДГОТОВКА К ПОСТАНОВКЕ ОСНОВНОГО ОПЫТА РСК: ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ТИТРА И РАБОЧЕЙ ДОЗЫ АНТИГЕНА, КОМПЛЕМЕНТА, ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ

СЫВОРОТКИ.

П о с т а н о в к а р е а к ц и и . Для реакции необходимы следующие ингредиенты: 1)

антиген; 2) исследуемая сыворотка; 3) комплемент; 4) гемолитическая сыворотка; 5)

эритроциты барана в 3% взвеси; 6) физиологический раствор.

Титром гемолитической сыворотки считают ее наибольшее разведение, вызывающее полный гемолиз.

Титрование АГ. Для выявления антикомплементарных свойств АГ титруют в

присутствии рабочей дозы комплемента. Титром антигена называется его наименьшая доза,

при которой прекращается задержка гемолиза. Для РСК используют рабочую дозу АГ, вдвое

уменьшенную против титра (во избежание антикомплементарного действия).

РСК, несмотря на ее сложность, обладает относительно высокой чувствительностью и

специфичностью, поэтому ее применяют для диагностики многих инфекционных заболеваний.

При инфекционных заболеваниях АТ, связывающие комплемент, появляются в первые

дни заболевания, однако титр их невысок. Обычно АТ накапливаются в высоких титрах на

7— 14-й день заболевания. Поэтому наиболее достоверными являются данные, полученные

при исследовании парных сывороток, взятых в начале заболевания и в период

реконвалесценции.

Вопрос 27

27. Неполные антитела, их характеристика. Обнаружение непол-

ных антител к резус-фактору у беременных женщин (реакция

Кумбса прямая и непрямая).

Неполные антитела содержат один Аг-связывающий центр и, поэтому, одновалентны. Второй Аг-связывающий центр у подобных Ig экранирован различными структурами либо обладает низкой авидностью.

Неполные антитела функционально дефектны, так как не способны агрегировать Аг. Неполные AT могут связывать эпитопы Аг, препятствуя контакту с ними полных антител; поэтому их также называют блокирующими антителами.

Реакция Кумбса.

Метод выявляет неполные (одновалентные) АТ, образующиеся при бруцеллезе, резус-конфликте или системных коллагенозах. Для постановки реакции необходима антиглобулиновая сыворотка, содержащая полные ( как минимум двухвалентные) АТ.

Прямая и непрямая реакция Кумбса

Тест Кумбса бывает непрямой и прямой, в зависимости от этого он производится в один либо же два этапа. В ходе осуществления прямой реакции Кумбса – с условием, что антитела уже закреплены на поверхности эритроцитов – антиглобулиновая сыворотка добавляется к сыворотке исследуемой крови, и осуществляется агглютинация эритроцитов.

В случае, когда в плазме крови антитела находятся в свободном состоянии проводится непрямой тест Кумбса. На первом этапе надо зафиксировать антитела на поверхности эритроцитов, для этого нужна инкубация эритроцитов и сыворотки крови. Потом добавляется антиглобулиновая сыворотка.

Неполные антитела в отличии от нормальных моновалентны, поскольку они имеют один активный центр, способный взаимодействовать только с одним эпитопом: в то время как другие эпитопы остаются не связанными. В результате этого не происходит образования крупных комплексов, выпадающих в осадок в растворе электролита. Последние проявляются только в реакциях с бивалентными АТ. Для исправления этого положения вводится антиглобулиновая сыворотка (АГС), содержащая бивалентные АТ к глобулину, которая свяжет между собой моновалентные АТ. Содержащиеся в исследуемом материале. Таким образом произойдет визуально видимая гемагглютинации или агглютинация, свидетельствующая о наличии в исследуемой сыворотке неполных (моновалентных) антител. Например, в случае беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом у нее в сыворотке крови появятся неполные антитела. Для их выявления в пробирку с исследуемой сывороткой крови вносят резус- положительные эритроциты, а затем АГС. Появление гемагглютинации свидетельствует о положительной реакции.

ВОПРС 28

В качестве метки используются светящиеся флюорохром-ные красители (изотиоционат флюорисцеина и др.).Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний — для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.

Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.

Компоненты прямой РИФ: 1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др.); 2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому антигену; 3) изотонический раствор хлорида натрия. Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой. Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию — свечение.

Компоненты непрямой РИФ: 1) исследуемый материал; 2) специфическая антисыворотка; 3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая флюорихромом; 4) Изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем — меченой антиглобулиновой сывороткой.

Светящиеся комплексы АГ-АТ — меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа. Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.

Также выделяют 4-компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ-АТ — меченые — АТ-комплемент.