Раздел 1. Изучение морфологических свойств

ДРОЖЖЕЙ

Для микроскопирования дрожжей следует приготовить препарат "раздавленная капля" из чистых культур дрожжей ‑ винных, пекарских и диких. Приготовленные препараты изучить под микроскопом со средним увеличением (с объективом х40). При этом необходимо рассмотреть, прежде всего, форму клетки и ее строение, обратить внимание на клеточную оболочку, цитоплазму, вакуоли и включения запасных питательных веществ. Цитоплазма при микроскопировании представляет собой темную зернистую массу, вакуоли и капли жира в виде светлых (блестящих) пятнышек, гликоген ‑ в виде уплотненных зерен. Необходимо убедиться в неподвижности дрожжевых клеток.

Затем изучают способы бесполого размножения дрожжей. Для этого нужно отыскать в поле зрения микроскопа почкующиеся клетки. Все препараты зарисовать при работе с объективом х40. На рисунках обозначить анатомическое строение дрожжевых клеток, почкующиеся клетки. В выводе указать отличие изученных препаратов дрожжей по форме.

Определить относительное количество живых и мертвых клеток в пекарских дрожжах ‑ старых и подмоложенных. К капле суспензии дрожжей на предметном стекле добавить каплю слабого раствора (1:1000) метиленового синего, размешать, накрыть покровным стеклом. Мертвые клетки прокрашиваются быстрее и ярче вследствие посмертного повышения проницаемости клеточной оболочки. Препарат зарисовать в цвете.

Раздел 2.Определение включений в клетках дрожжей

В процессе жизнедеятельности микроорганизмов в цитоплазме клеток могут формироваться морфологические образования, представляющие собой либо продукты обмена клетки, либо запасные питательные вещества. Включения различны по своей химической природе. Это могут быть жироподобные вещества, полисахариды (гликоген, крахмал, гранулеза), серополифосфаты (волютин), кристаллы щавелевой кислоты и др. Они не являются постоянными компонентами клетки, они образуются в зависимости от условий культивирования, возраста культуры и могут использоваться в метаболизме клетки.

Клеточные включения могут выявляться цитохимическими методами.

а). Определение полисахаридов (гликогена и гранулезы)

1. На предметное стекло наносят небольшую каплю микробной суспензии, добавляют каплю концентрированного раствора Люголя и выдерживают 10-15 минут при комнатной температуре.

2. Накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости и микроскопируют с сухой системой либо с иммерсией.

Гранулы крахмалоподобных веществ (гранулеза) окрашены в синий, а гранулы гликогеноподобных веществ (крахмал) ‑в красновато-коричневый цвет.

Окрашивание гликогена происходит в кислой среде, поэтому перед выявлением в клетках гликогена среду, в которой выращивали микроорганизмы, подкисляют либо на предметное стекло вместо воды наносят каплю 0,5%-го раствора HCl и в ней эмульгируют исследуемую культуру.

б). Обнаружение жироподобных веществ

Жировые включения или липидные гранулы в клетках микроорганизмов могут быть представлены нейтральными жирами и поли-β-оксимасляной кислотой. Коэффициент преломления жиров и гранул, состоящих из нейтральных жиров, отличается от коэффициента преломления протоплазмы, поэтому в препарате "раздавленная капля" жир виден в клетках в виде блестящих ярких капелек. Препарат необходимо рассматривать в затемненном поле зрения, опустив конденсор и закрыв диафрагму (объектив х40). Гранулы поли-β-оксимасляной кислоты выявляют с помощью жирорастворимого красителя судана III.

1. Наносят каплю густой микробной взвеси на предметное стекло. Добавляют каплю формалина (40%-го), либо 5%-го раствора HCl и выдерживают 5 минут (формалин убивает клетку и разрыхляет ее оболочку).

2. Добавляют каплю метиленового синего (1:10 либо 1:40) и выдерживают 10 минут.

3. Добавляют каплю концентрированного раствора судана (III) в 90% этаноле и выдерживают 5 минут. Накрывают покровным стеклом. Микроскопируют с сухой или иммерсионной системой.

Клетки окрашены в синий, включения жира - в розово-оранжевый цвет.

в). Выявление волютина

Волютин-полиметафосфат, в клетках чаще содержится в виде зерен диаметром 0,3 мкм, иногда в дисперсном состоянии. Волютин встречается в клетках многих бактерий и большинства дрожжей. Волютин дает явление метахромазии; на этом основана его окраска метиленовым синим. Волютин растворяется в слабых кислотах и щелочах, но после окраски становится кислотоустойчивым, на этом основан метод Омелянского.

Окраска метиленовым синим: фиксированный мазок дрожжей окрашивают метиленовым синим 3-5 мин, промывают, сушат и микроскопируют в иммерсионной системе. Зерна волютина выглядят красно-фиолетовыми на фоне голубой протоплазмы.

Метод Омелянского: фиксированный мазок окрашивают в течение 30 с фуксином Циля, затем обесцвечивают 1% раствором серной кислоты 30 мин. и после промывания водой докрашивают метиленовым синим 1 мин.; промывают водой, высушивают и микроскопируют в иммерсионной системе. Зерна волютина ‑ ярко-красные, протоплазма ‑ голубая. Препараты зарисовать в цвете.